未来已来，大有可为——DDR通路基因面面观
众所周知，DNA损伤（DNA Damage）的来源可以是内源性的，来自细胞内部（如与水的反应、代谢副产物或内源性活性氧），也可以是外源性的（如环境因素、放疗或化疗）。为了保持基因组的完整性，细胞进化出多种复杂的、互补的和部分重叠的途径来识别和修复损伤。关于DDR通路基因分类、在各癌种中的变异情况、意义及其与临床的结合方式，求臻医学将在今天的文章中为大家详细阐述。
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DDR通路基因是什么？
不同形式的DNA损伤会引起这个复杂系统的不同分支的反应。在DNA损伤后，受体蛋白结合细胞周期检查点和DNA损伤检查点激酶并向其发出信号。诱导细胞周期阻滞并启动适当的DNA损伤修复（DNA Damage Repair, DDR）通路来处理特定类型的损伤。如果修复成功，细胞恢复复制；否则，就会触发细胞程序性死亡或衰老机制。如果DNA修复机制异常，基因组就会不稳定，这是癌变的标志之一。
图1.DDR通路及相关抑制剂
单链断裂（SSB）是DNA损伤最常见的形式，但双链断裂（DSB）对细胞的危害更大。目前，大多数DDR靶向疗法针对的是DSB相关的信号传导和修复机制，抑制DSB修复的细胞周期检查点，从而增加DSB发生频率（图 1）。由于DSB中的同源重组（HR）修复过程保真度较高，如果该通路受到影响，则基因组的不稳定性会显著增加。随着针对不同DDR通路特异有效的分子靶向药物（DDR抑制剂）的快速发展（图 1），抗癌治疗已经进入新篇章。目前PARP抑制剂已经应用于临床，但用于评估其他DDR抑制剂疗效的生物标志物和临床检测方法的开发却显得滞后。
DDR通路基因分类
具体来说， DDR途径又可细分为8大核心通路及关联通路（图2）：
图2.DDR核心通路与关联通路
范可尼贫血机制（Fanconi Anemia，FA）
一种DNA修复障碍，涉及多种途径，并且对常见癌症广泛发挥作用，包括乳腺癌、卵巢癌和头颈癌。
表1 FA通路基因
同源重组修复通路（Homologous Recombination Repair，HRR）
HRR通过修复DSB、间隙和重启停滞的复制叉来维持基因组的稳定性。这是一种相对缓慢精确的修复机制，它依赖于基因组中的同源序列作为模板来修复受损的DNA片段。主要发生在细胞周期的S和G2期。
表2 HRR通路基因
非同源末端连接通路（Nonho-mologous End-joining，NHEJ）
真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，为避免因DNA或染色体断裂而造成的DNA降解或对细胞活力的影响，强行将两个DNA断片连接在一起的特殊的DNA修复机制。相比之下，NHEJ是一个快速但更容易出错的过程，过度使用可导致基因重排、缺失和突变，这些均可导致细胞更易受到DSB的伤害。
表3 NHEJ通路基因
碱基切除修复（Base Excision Repair，BER）
BER负责对基因组保真度和稳定性具有重大威胁的，较小但高度诱变的DNA损伤进行修复。这些DNA损伤可由电离辐射以及氧化、甲基化、脱氨基等代谢活动或DNA碱基对的自发丢失所产生的内源性诱变引起。BER通路由11种识别受损碱基的DNA糖苷酶之一启动。碱基切除后，通过单个碱基或多个碱基填充暴露的间隙。
表4 BER通路基因
直接修复（Direct repair，DR）
直接修复是最简单的DNA修复形式，因为它主要依赖于单个蛋白的活性，且无需进行核苷酸去除、重新合成或结扎。三种常见的病变类型是O 6-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤和 3-甲基胞嘧啶。
表5 DR通路基因
错配修复通路（Mismatch Repair，MMR）
MMR在修正复制错误中起着至关重要的作用。它纠正了由5-甲基胞嘧啶的自发脱氨基作用和基因重组后形成的异源双链核酸分子所产生的错误配对。该通路的缺陷会导致一种“突变体”细胞表型，其特征是突变频率升高和微卫星不稳定性（MSI）增加。几种人类MMR基因的突变导致对遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）的易感性，以及多种表现为MSI的散发性肿瘤。
表6 MMR通路基因
核苷酸剪切修复通路（Nucleotide Excision Repair，NER）
NER是一个复杂的多步骤过程，涉及30多种蛋白组成的大网络，它是最灵活的机制。首先识别受损碱基，然后解开DNA双链，并通过切除修复复合物去除受损碱基，最后进行填充和结扎。最显著的损伤底物是UV光诱导的嘧啶二聚体，其次是大体积化学加合物、DNA链间交联和某些形式的氧化损伤。这些损伤会导致DNA双链螺旋扭曲和化学改变，且两者都是NER识别的标志性特征。
表7 NER通路基因
DNA跨损伤复制（Translesion Synthesis，TLS）
如果受损的 DNA 碱基或复合物在复制开始之前没有修复，它们可能会停止复制叉，导致遗传不稳定。TLS 会招募专门的DNA 聚合酶来到这些位点合成 DNA。
表8 TLS通路基因
DDR关联通路
关联通路有染色质重构、端粒维持、检查点因素、泛素反应、p53通路和染色体分离等。
表9 DDR关联通路基因
DDR通路基因在
各癌种中的变异情况
分析TCGA数据库，不同癌种中普遍存在DDR基因的突变。如子宫内膜癌（UCEC）、结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）中有较高频率的基因突变；而卵巢癌（OV）、肉瘤（SARC）和食道癌（ESCA）具有大量的基因拷贝数变异（图3）。而在具体的研究中，DDR通路基因变异也是广泛存在。
图3.在不同癌症类型中DDR 通路基因突变类型和突变频率的情况
肺癌中的DDR基因
一项针对266名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的研究，其中 132 名患者（49.6%）的肿瘤被定义为 DDR 阳性，其余 134 名（50.4%）被定义为 DDR 阴性（图 4）。总体而言，在 132 例 DDR 阳性病例中发现了 201个DDR基因的有害突变。其中，143个（71.1%） 是错义突变，其余的是无义突变、剪接位点和移码突变。在 DDR 阳性 NSCLC 中，最常见的DDR突变基因是ATM（9.4%）、ATR（4.8%）、BRCA2（4.1%）、POLQ（3.7%）和RAD50（3.0%）。
图4.研究中NSCLC患者DDR基因突变情况
乳腺癌中的DDR基因
在乳腺癌中也有DDR基因变异的相关报道（图5）。约10%的病例与BRCA1或BRCA2的胚系缺陷有关。对不同亚型，DDR基因的突变情况不同：HER2阴性乳腺癌中，胚系BRCA突变与较早的诊断年龄和家族史有关，另外还发现了其他DDR基因的突变。在激素受体阳性HER2阴性的转移性乳腺癌患者中，有4%的病例中发现了BRCA1、BRCA2 或 ATM 的体细胞突变。CDK12基因在10%以上的浸润性乳腺癌样本中发生扩增或突变。关于三阴性乳腺癌（TNBC），一项详细的调查分析了56个DDR基因，发现了其中的异质性，包括BRCA、非BRCA、HR和非HR基因的突变。
图5.乳腺癌中DDR通路相关基因的研究
肝癌中的DDR基因
一项针对原发性肝癌（PLC）的研究显示，357例患者中有92例（25.8%）存在至少1个DDR基因突变，其中肝细胞癌（HCC）患者49例，肝内胆管癌（ICC）患者37例，混合型癌（H-ChC）患者6例。最常见的突变类型是替换/插入缺失（54.24%），其次是截断（36.44%，图6）。最常突变的DDR基因是ATM （5%）。对于不同病理亚型，DDR突变的频率和分布各不相同。共有6.07%的HCC患者有ATM突变，而ICC患者具有高BRCA1/2突变（9.02%）。ATR、APEX1和MUTYH 的突变仅在HCC患者中发现。POLE和POLD1突变可导致遗传不稳定和癌症突变积累。在DDR基因的六个功能类别中，CPF的突变在HCC中富集，而HRR的突变在ICC中更常见。
图6.不同亚型肝癌中DDR基因突变情况
结直肠癌中的DDR基因
最近的研究表明，一部分结直肠癌（CRC）的特征在于胚系或体系DDR基因的缺陷（图7）。 据报道，CRC中体系DDR缺陷的发病率在 10%到30%之间。同时，有研究显示DDR与结直肠肝转移和脑转移也有关系。
图7.结直肠癌中涉及的DDR通路
DDR通路基因的意义
遗传风险
在结直肠癌中（CRC），MMR通路胚系变异导致的Lynch综合征患者使结直肠癌的发病年龄早于一般风险人群，因此，接受肠镜筛查的初次年龄需提前至20到25岁，确诊Lynch综合征，能够指导患者家属接受Lynch综合征相关肿瘤的筛查，降低发病率和死亡率。同时，BRAC1病理性胚系变异是CRC的高危因素，并且BRCA1/2突变与早发型CRC相关。
尿路上皮癌患者的胚系变异常发生于DDR通路中，尤其是BRCA2及MSH2基因。且BRCA2及MSH2胚系变异携带者患尿路上皮癌风险增加。DDR基因胚系突变可以指导肿瘤患者的治疗及其家系癌症筛查，也可以作为靶向/免疫治疗的潜在分子标志物。传统的遗传综合征的筛查标准可能会遗漏部分胚系变异携带患者。扩大胚系筛查范围是具有潜在价值的，尤其是对于发病年龄较低的患者以及上尿路上皮癌患者。
图8.尿路上皮癌中的胚系变异图
表10 尿路上皮癌中DDR基因胚系突变情况
综述分析，DDR基因胚系突变频率在全部前列腺癌（PC）患者中为18.6%，mPC为11.6%，mCRPC为8.3%。在家族性前列腺癌中，中位DDR胚系突变频率为12.1%，BRCA2基因突变频率为3.7%。
当DDR基因发生致病突变会导致肝内胆管癌（ICC）易感性。同时，针对于原发性肝癌（PLC）患者，DDR基因胚系有害性突变和家族史可作为未来患病风险预测因子。
图9.三个具有DDR基因胚系有害突变的原发性肝癌家系图
预后判断
在结直肠癌的回顾性研究表明ATM多态性与晚期化疗方案的生存获益显著相关，并且ATM突变患者预后更好。
图10.具有ATM突变晚期结直肠癌患者的生存图
在晚期前列腺癌研究中，基于血液中ctDNA的靶向测序，发现DDR基因和其伴随的驱动基因突变可以更好地预测患者的预后。其中BRCA2、ATM和CDK12是ctDNA中突变频率最高的DDR基因，在15％的可评估病例中均存在突变。转移进展前即出现DDR突变，在94％的连续ctDNA样品中以及原发组织中重新检测到DDR基因突变。BRCA2和CDK12的缺失与不良的临床预后相关。
图11.具有不同DDR基因突变晚期前列腺癌患者的生存图
一项针对 854 例接受手术的散发性胰腺导管腺癌（PDAC）患者的研究利用 NGS（二代测序技术）分析了患者胚系DDR变异情况，并鉴定了22个DDR基因胚系变异。变异分为致病突变、良性突变及意义未明突变（VUS）。研究最终纳入 122 例含有一个或多个胚系 DDR 基因变异的患者（其中 19 例为致病变异，103 例为 VUS 变异）和 375 例DDR基因突变野生型的患者做进一步的生存预后分析，随访时间为 20.2 个月。发现胚系 DDR 基因变异是评估散发性 PDAC 患者预后的重要因素之一。与无 DDR 基因变异的患者相比，存在 DDR 基因变异患者的 DFS 与 OS 有明显的改善。
图12.具有不同类型的DDR基因胚系突变胰腺导管腺癌患者的生存图
化疗疗效判断
还是这项针对胰腺导管腺癌（PDAC）研究，更重要的发现是，对于存在DDR基因变异的PDAC患者，接受辅助化疗能够明显延长患者的DFS和OS，提高患者的生存获益。
图13.具有害突变DDR基因胚系突变的胰腺导管腺癌患者辅组化疗的生存图
既往研究表明，DDR基因在尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌中的能够有效预测铂类化疗疗效,广州中医药大学第一附属医院开展的一项DDR基因预测晚期NSCLC患者接受含铂化疗疗效的回顾性队列研究显示与DDR WT的患者相比，DDR MUT的NSCLC患者接受含铂化疗，具有更长的中mPFS、更高的ORR和DCR，DDR突变可能是NSCLC患者接受铂类化疗疗效的预测生物标志物。这有助于我们筛选出最有可能从铂类化疗获益的NSCLC患者。
图14.具有DDR基因突变的非小细胞肺癌患者铂类化疗的生存图
PARPi疗效判断
目前美国FDA批准3种PARP抑制剂、中国NMPA批准2种PARP抑制剂应用于临床，其适应证见下表
表11 PARP抑制剂在美国FDA或中国NMPA获批适应证
BRCA基因突变是首选的PARPi敏感生物标志物已经毋庸置疑，其他HRR基因，如RAD51、ATM、PALB2、MRE11等损伤或缺失也会导致HRD，因此HRD作为PARPi敏感的生物标志物已应用于临床。除了卵巢癌外，在乳腺癌、前列腺癌和胃肠道肿瘤等癌症中，PARP抑制剂治疗多种晚期癌症患者的 I/II/III 期试验已经显示出了不错的抗肿瘤反应。
表12 正在进行的PARP抑制剂III期临床试验
表13 PARP抑制剂的非注册和联合治疗临床试验
免疫疗效判断
晚期结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）患者的生存率较早期患者低。免疫检查点抑制剂（ICI）可改善患者生存情况。尤其对于中国CRC患者，DDR 基因突变扩大了 ICI 治疗的受益范围，尤其是MSS/DDR-Mut CRCs。MSS组中DDR突变患者的占比约为11%。研究结果提示，DDR基因突变可作为CRC患者接受ICI治疗的预后生物标志物，作为TMB的补充生物标志物，尤其是在筛选MSS型CRCs潜在的ICI获益人群有着深远的潜在价值。
图15.具有DDR基因突变的晚期结直肠癌患者免疫治疗的生存图
在非小细胞肺癌中（NSCLC），DDR基因十分常见。伴有DDR有害突变患者TMB值显著增加，可独立预测免疫检查点抑制剂的疗效和生存获益。
图16.具有DDR基因突变的非小细胞肺癌患者免疫治疗的生存图
来自中国医学科学院北京协和医学院分子肿瘤学国家重点实验室的研究表明：DDR通路可以指导免疫治疗。具体来说DDR通路中的基因共突变是TMB评估的较优替代；co-mut+与免疫调节因子的mRNA表达具有相关性；co-mut+状态可预测ICB治疗的临床获益；在PD-L1表达<50% 或TMB-L患者中，DDR co-mut+患者仍能从抗PD-1的治疗中获益。
图17.具有DDR基因突变的实体瘤患者免疫治疗的生存图
注：同源重组修复和错配修复 （HRR-MMR） 或 同源重组修复和碱基切除修复 （HRR-BER）定义为 co-mut +
DDR通路基因与临床的
结合方式
由于DDR系统涉及8条核心通路的众多基因（上百个），其与临床的结合方式也是多种多样，究竟哪种结合方式才能擦出不一样的火花，形成燎原之势。
简单粗暴式
有通过少数几个DDR基因（3-12个）的突变情况进行研究的，也有通过发生DDR基因突变数目进行研究的。
随着基因数目的增加，也有将变异分类的：致病突变、良性突变及意义未明突变（VUS）。用致病突变和野生型进行比较的。
当然也有按照突变类型这样分类的：DDR阳性定义为无义突变，移码突变，剪接突变，错义突变（COSMIC评估为致病性、Clinvar评估为致病性、Polyphen-2评分≥0.95）；DDR阴性定义为DDR可能有害、DDR良性、DDR阴性。
排列组合式
如上文介绍的，DDR又可细分为八大核心通路，FA、HRR、NHEJ、BER、DR、MMR、NER和TLS。所以也有按通路进行研究的，不同DDR通路之间存在潜在相互作用，如具有HRR-BER或HRR-MMR基因共突变的患者比其他DDR通路共突变的患者显示出更高的TMB和NAL（新抗原负荷）。
综合考虑式
除了单纯的DDR通路基因进行分析的还有综合其他指标，如TMB、MSI和其他临床特征等进行的多元分析或者直接构建DDR评分模型。
相信随着研究的深入，其与临床的结合方式会越来越精细（复杂），但不管采取哪种结合方式，首先肯定要测得全，其次测得准，最重要的是分析的透。求臻医学的ChosenOne®599含有101个DDR核心通路相关基因，尽可能的实现一网打尽。
表14 基因组不稳定相关通路
精准医疗
没有一劳永逸的办法
只有永不停歇的探索
天下大势
分久必合（异病同治）
合久必分（分而治之）
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