刨根问底II聊一聊清除PCR扩增产物污染措施的工作原理
验小六的晚课时间
关于PCR实验室清除核酸扩增产物污染的那些措施，在过去一年中已通过各类途径反复学习和实践过。今天，我们就来聊聊它们的工作原理。
1
含氯消毒剂
凡是能溶于水，产生次氯酸的消毒剂统称含氯消毒剂。
次氯酸确切作用机制尚不明确，但是认为它的氧化作用可以使蛋白变性从而达到有效杀灭细菌、真菌和病毒的作用。
通常所说的含氯消毒剂中的有效氯，并非指氯的含量，而是消毒剂的氧化能力，相当于多少氯的氧化能力。
特点有广谱、高效、低毒、强刺激性气味，有腐蚀性、漂白的作用，由于受有机物影响很大，所以不稳定，需要当日配制当日使用。
PCR实验室常用的含氯消毒剂大都使用84消毒液、含氯消毒片、分析纯次氯酸钠溶液配制。
（1）84消毒液：主要成分为次氯酸钠。市面上在售的84消毒液有效氯含量因不同厂家略有差异，通常为2%-10%。
（2）含氯消毒片：主要有效成分为三氯异氰尿酸（是一种有机化合物，是一种极强的氧化剂和氯化剂），有效氯含量为450-550mg/片。
（3）分析纯次氯酸钠溶液：属于高效的含氯消毒剂。一般认为次氯酸是次氯酸钠灭菌的有效成分。
10%次氯酸钠溶液：采用分析纯次氯酸溶液与纯水进行配制。有效氯浓度为0.5%。
次氯酸钠清除PCR扩增产物污染的原理：
次氯酸钠能在PCR扩增产物（DNA双链）上造成广泛的“缺口”，阻碍核酸聚合酶延伸，因此可以用于PCR产物污染的控制。
一般建议PCR实验室不要直接使用84消毒液或者使用其配制，因其确切浓度未知。
2
醇类消毒剂
乙醇溶液成本低，消毒作用快，易挥发，对人和物品一般无损害，被普遍病毒、细菌和真菌等微生物的消毒。
乙醇的确切作用机制尚不清楚，一般认为乙醇与水混合后有很强的渗透能力，可破坏病原微生物的细胞膜或病毒包膜，导致其裂解、蛋白变性、死亡或失活。
PCR实验室常用的乙醇溶液有70%乙醇、75%乙醇。
（1）75%乙醇（酒精）消毒液：商品化的酒精消毒液。
（2）70%乙醇溶液：采用市售分析纯无水乙醇与纯水进行配制。
乙醇有效的杀菌浓度范围为60%-90%，浓度低于50%或无水乙醇消毒效果明显减弱，有研究认为，70%浓度最为有效。
3
核酸/核酸酶去除剂
国内外针对新冠病毒核酸检测的规范要求中，均提到可采用核酸清除剂等试剂进行残留核酸清除。
这类核酸/核酸酶去除剂的优势是，采用生物降解或者化学降解的方式有效去除物体表面的DNA/RNA及DNA/RNA酶，对人体无毒，不含腐蚀性酸和碱，不损坏金属。
（详细了解可回看文章-“PCR实验室应用“核酸污染清除剂”是有必要的！”）
4
紫外线（UV）照射
每次完成检测操作后采用紫外灯对实验台面或相关仪器设备进行照射，是临床PCR实验室不可少的消除或减少扩增污染的一种方法。
紫外线照射清除核酸污染的主要机制是，基于碱基的氧化，从而使单链和双链断裂并在临近的嘧啶碱基证件形成环丁烷环，环丁烷环形成链内嘧啶二聚体，抑制聚合酶介导的链延伸。
紫外线时照射的距离、强度和时间对清除核酸污染的效果是非常关键的。
（详细了解紫外线照射消毒的要求细节可回看文章-“关于紫外线灯的那些事！”）
结束语
细节决定成败，尤其对于实验环境和操作要求极高的PCR实验室，任何一个环节做不好都可能影响整个实验结果。因此，检验人员应时刻铭记“无核酸”“无基因”的概念，把防污染思想贯穿于整个实验过程中，严格遵守操作规程，保证检测质量。
参考资料：
《实时荧光PCR技术》
《新型冠状病毒感染临床检测技术》