外泌体是什么?
外泌体样本预处理与分离、保存:
外泌体存在于人类或动物的各种体液中,我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体,分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体,必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。
1)细胞培养上清 2)血浆/血清
3)尿液 4)脑脊液
5)卵泡液 6)宫腔液
7)胆汁 8)羊水
9)腹水 10)胸腔液
不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样,如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。
从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来,主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤,目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”,也是高分文章中首选的分离方法。
外泌体超离大致步骤
外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。
(1) 透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
外泌体透射电镜图
外泌体NTA图
外泌体Western Blot图(Tian Su et al., ACS Nano. 2019)
外泌体高通量检测
外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
1. miRNA高通量测序
2. 表达谱芯片(人、小鼠)
3. lncRNA芯片(人、小鼠)
4. ceRNA芯片(人、小鼠)
5. 蛋白质组分析(iTRAQ、TMT、Label-free)