流式细胞术出现40年来一直是分析单细胞复杂通路及反应的重要工具，然而其系统上的优势却未被充分利用。近年来由于生物制药的不断发展，再加上流式微球与细胞的复合能力，可实现多维度追踪细胞表型和功能的研究，使得流式细胞术引起了广泛关注，在药物研发中的应用也越来越多。不仅可以对细胞胞内和胞外的成分进行检测，也可以对血清或血浆样本中的可溶性分析物进行测定，如细胞因子、药物复合物或抗药物抗体（ADA）。
图1 Beckman多色流式细胞仪
流式细胞仪可以以每秒数百至数万个细胞的速度进行单细胞分析。高通量、快速度的优点非常适合大规模的药物研发与检测。流式细胞术可以在一个细胞表面进行多个参数的检测，配合数据分析系统可以产生充分且复杂的数据流，明确地排除在单参数试验中的假阳性。另外，流式细胞术可以使用多种荧光染料和探针，可以有更多更灵活的选择，如目前最先进的质谱流式可以选用多种金属元素探针。
流式细胞术对于单个细胞的特性的分析包括细胞表面或内部抗原表达、亚细胞组件（如，线粒体）和细胞动态属性（如，蛋白表达变化、钙流以及膜电位、细胞增殖）等。本文主要介绍流式细胞术在药物研发与研究中的应用和基本技术流程，着重介绍流式细胞术在药物临床生物分析中的特点，包括生物治疗剂的PK研究、免疫原性分析中基于细胞的中和抗体（NAb）评价、PD相关生物标志物中特殊细胞群体的免疫表型分型监测和受体占位分析。
流式细胞术的应用范围很广，在药物研发全过程中的各个环节都有应用，包括药物研发与靶点确认、非临床安全性与毒性评价以及临床研究等方面。图2 流式细胞术在药物发现、靶点验证、毒理学和临床试验等方面的应用[1]一、药物研发过程中的靶点确认、药物特性以及化合物筛选如今采用几个单参数试验来证明药物筛选的有效性已受到质疑，只有在单细胞水平上同时测量多个参数，才能深入了解化合物复杂的相互作用机制（MOA）和亚细胞群体间的相互作用。近年来工程细胞系（transfec、siRNA基因敲除等）被用于靶标验证相关的药物开发的模型（多为中国仓鼠卵巢（CHO）），这些细胞系通过稳定表达重组靶点的设计而用于检测，如与细胞目标抗原结合的（嵌合体、人源化或人源化的）单克隆抗体药物通过与靶点结合来进行药效和PK分析，或检测抑制药物结合的中和抗体；还可用体外培养的细胞进行补体介导的细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）等检测。非临床研究中可采用流式细胞术进行药物的体内、体外安全性评价。在毒理学评估中，流式细胞术提供了更高的精确度和更低的变异性，降低了时间、试剂和动物上的成本。通常在这个阶段进行生物标志物和临床研究的初步剂量范围的确定。流式细胞术已用于评估药物引起的血管损伤（细胞死亡和循环内皮细胞试验），同时测量T/DC细胞活化的变化或蛋白质在特定细胞亚群上的表达水平，可以更广泛的描述毒性影响、造血或免疫调节。在人类和动物研究中，流式细胞术在骨髓分型分析上具有更多优势。除了确定毒性外，流式细胞术还可以进行靶点的调节和功能测定，以了解药物毒性评估期间的MOA。非临床研究中几乎可以使用任何样本类型，包括骨髓、脾脏、淋巴结等，外周血是最常见的样本类型。
流式细胞术在临床生物分析中的应用主要为细胞表型、功能测定、药效动力学和免疫原性评价。对于靶向胞外抗原的一类生物治疗剂（如靶向PD-1、CD28的单抗），可以使用流式细胞术评价受体在细胞表面的参与程度，或受体占用情况。这对于药物的临床剂量确定有着重要的参考意义。此外，生物治疗药物的PK研究也是基于抗体药与活细胞表面靶点的结合，也可以通过流式细胞仪进行分析。流式细胞术可测定细胞功能，即对药物的响应，比如细胞因子的产生和变化（比ELISA灵敏度高）、胞内信号传导和细胞增殖等。功能测定也被作为癌症疫苗效力评估的效能生物标记物。对于致靶细胞凋亡的药物（如利妥昔单抗），功能测定被作为安全性相关的生物标记物。功能性检测也可以用于免疫原性评估中。但是功能性检测由于需要体外刺激和培养的限制在临床分析上不常使用。流式细胞术可通过检测特定的细胞群来进行药效评估，比如利妥昔单抗治疗中通过检测CD3+CD8+T细胞、B细胞、NK细胞群评估药效。用流式细胞术分群可以在淋巴细胞分型的基础上进一步分型至小亚群，这些亚细胞群和内皮细胞、循环转移瘤细胞以及CD34干细胞等群体可作为药效相关的生物标志物来检测。免疫原性评价在生物治疗剂的临床分析中的重要性不言而喻。对于免疫原性分析通常都会涉及cell based assay和流式细胞术的应用。流式细胞术是一个复杂的方法，需要详细了解流式细胞仪、荧光色素、光谱重叠、细胞谱系标记、细胞内过程和数据分析。一般来说，流式分析时首先要获得单细胞，并使用细胞活力染料标记细胞（区分活细胞和死细胞），再将细胞与需要检测的抗体一起孵育，然后选择荧光二抗共孵育。如果要对细胞内部蛋白进行标记，则需要对细胞进行通透化处理。处理后的细胞样本通过进样器被输送进入流式细胞仪。单个细胞上的荧光信号经过处理，从而可以对单个细胞所结合的抗体进行定性和定量分析。数据的储存格式是FCS文件（通用流式文件），可使用多种方式进行分析和可视化。图3是对不同来源样本的处理流程图。流式细胞术在生物分析应用中的内容涉及多个方面，虽然这些检测的目标不同，数据的输出方式也不同，但有其共性。流式细胞术的特点决定了其在PK研究、免疫原性评价和PD生物标志物分析及验证中的特殊性。流式细胞术在PK研究中的应用主要从生物治疗药物和细胞治疗剂两方面分别介绍。生物治疗药物的PK研究可使用间接免疫荧光法。该方法与基于平板的LBA相同，都依赖于抗原-抗体或受体-配体的结合作用。也可以将抗原、抗药抗体、受体或配体偶联到微球上，使用荧光染料偶联的二级检测试剂（以下称二抗）对药物进行定量。总的来说，流式细胞术更能保证药物的构象与活性，与药物疗效和安全性参数的相关性更好，且可以实现多参数同时检测，有利于发现药物或靶点相互作用的相关性。一般来说可通过与荧光染料（FITC、PE等）结合的二抗来实现不同水平的结合药物的检测，生成药物浓度对信号的剂量-响应曲线（标准曲线），然后通过从标准曲线内插信号来量化未知样本的药物浓度。流式细胞术用于药物PK研究的要点在于细胞的选择、抗原表达的变化以及验证要求中的已测样本再分析（ISR）。尽量选择表面靶标表达量高、均一性高的细胞。可以用原代细胞、细胞系或者基因改造的细胞。首选具有高表达水平表面抗原的细胞，这可以使药物定量的动态范围更广，信号/背景（有药物存在的信号/无药物的信号）在标准曲线范围内一般至少有2.5倍的差异。由于药物与细胞内抗原结合的程度取决于细胞膜的通透性，因此不能使用表达胞内抗原的细胞。一般选择新鲜细胞进行PK分析，以便最好地保持天然靶标抗原的构象。如果使用固定细胞或冻干细胞，抗原表位可能改变，则需要证明其与药物的结合与新鲜细胞的结合的一致性和/或可比性。在选择细胞时经常会出现某一抗原在多种细胞系的表面都有表达的情况，这时需要确定抗原表达的均一性，在流式分析的直方图（MFI-细胞数量）中，一个狭窄的对称钟形峰值在MFI mean和MFI median是近似的，表明抗原表达是均一的。而非常宽的峰型、拖尾或双峰则表明细胞上抗原表达不均一，这会导致MFI的变化，实验重现性较差。因此PK评估中通常读取MFI median。在细胞的培养过程中会出现的抗原脱落和调节（内化）等，如外周血单个核细胞（PBMC）在体外经历了有限的扩增或需要细胞因子/生长因子的刺激扩增，可能改变细胞表型，如表面抗原的表达。应进行细胞传代分析以确定限度，保证抗原的表达量较高且稳定。可建立主细胞库并生成工作细胞库，以支持分析方法开发、方法验证以及临床样本分析。建立最佳低温保存和细胞解冻程序，保证细胞存活率和细胞再生能力，并保持抗原表达的一致性。
图4 药物X与人PBMC的剂量依赖性结合 （FITC与细胞数量的MFI中值）。每个直方图显示药物X浓度（μg/mL）和相应的MFI中值[2]
大多数配体结合试验，包括流式细胞术PK试验中的药物靶点抗原结合都具有S形剂量响应，常用的模型是四参数非线性曲线拟合。理想情况下，未知样本的内插值期望在理论值的80-120%范围内。图4显示了多克隆抗体药物（药物X）用于人类的PK分析，表明药物以剂量依赖的方式与表达目标抗原的PBMC结合。图5显示了药物X剂量-反应曲线。总的来说，流式细胞术PK分析的方法验证研究设计与其他PK方法类似，如ELISA和质谱检测，都需遵循已出版的指南及验收标准，如图6。有研究对药物流式细胞术PK分析方法与基于ECL的PK分析方法进行了比较研究。关键性能参数均能满足验证要求，且两种检测方法都是准确和精确的。流式细胞术PK分析方法的成功验证，使其成为PK研究的一种新选择。如今ISR已成为验证PK分析方法的监管要求，而由于细胞表面抗体的微妙变化使得流式细胞术在ISR分析上有一定的局限性，但可以通过对细胞的分级建库来解决。如果选择使用微球则不受此限制。近年随FDA批准的CAR-T细胞治疗剂的成功上市，新名词“细胞动力学”横空出世，用于评估注射入人体内的活细胞药物的水平。目前可采用qPCR和流式细胞术对目标细胞进行定量，但由于基因表达的不确定性，PCR的检测可能受到基因沉默的影响，而流式细胞术能更详细的确定正在扩增的CAR阳性细胞中是否存在非T细胞群体。对于细胞及基因治疗药物，其异质性增加了在单个细胞基础上的多样性。因此，测量细胞的纯度是非常重要的。在CAR-T细胞治疗中，自体（患者）或异体（供体）T细胞被纯化，通过基因工程表达针对肿瘤特异性表面抗原的受体，并在实验室中扩增。这些扩增的细胞被重新注入到癌症患者体内，并以非MHC限制性的方式与肿瘤细胞表面抗原结合，增殖并杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞动力学的测定对于评估体内抗原暴露后相关的扩增和随后的持久性至关重要。根据CAR-T细胞治疗的各种临床试验最新数据表明，注入扩增的CAR-T细胞在随后的2周内达到峰值并在数月内缓慢下降，甚至在数年后仍可在患者体内检测到CAR-T细胞。流式细胞术同时检测多个标记物的能力非常适合研究这些T细胞的表型和功能特征。流式细胞术用于细胞治疗药物的“细胞动力学”研究的特点在于基线样本获取、样品稳定性、商用试剂采购以及验证的法规指导。2.1 CAR-T细胞样本（如全血、骨髓、脑脊液）的获取在自体CAR-T细胞治疗中，患者接受自己的T细胞，不可能在治疗前获得患者的基线样本。因此，需要使用含有相同CAR分子的健康供体样本来制备CAR-T细胞。然后将这些CAR-T细胞与健康供体的样本混合并用于方法开发。与血浆或血清样本的分析不同，在大多数情况下，冷冻全血、骨髓、脑脊液样本供细胞流式细胞术分析是不可能的，样品需要在一个非常有限的稳定期内处理和分析，通常是2~3天。市场上针对T细胞表面CAR分子的试剂很少，这导致缺乏用于鉴定抗原特异性CAR的“金标准”，并使CAR检测的标准化变得困难。如CD19 - IgG -融合蛋白，这增加了实验室额外的时间和费用来生成和表征针对CAR分子的试剂。目前在临床研究阶段的CAR-T的靶标也不限于CD19，那么对于相关试剂的获取也成为一个挑战。虽然FDA生物分析方法验证指南中很好地描述了PK检测与验证的要求，然而流式细胞术不同于配体结合试验和其他生物标记物试验，其中一些验证参数是不适用的，如准确性和特异性。此外，由于样品稳定性短，细胞表达量变化，对PK分析方法验证进行的ISR分析又是一挑战。因此，PK方法验证所使用的各种技术平台的差异需要来自监管机构的明确指导。可以参考药学科学界已经发表的流式细胞分析方法验证的白皮书。
二、免疫原性研究
基于流式细胞技术的免疫原性主要用于抗药抗体阳性样本中的中和活性检测，并纳入分层设计研究中，以检测和表征临床（或非临床）样本的特定抗药抗体反应。然而，针对流式细胞术的检测验收标准需要将细胞的生长特性、靶点的表达水平和细胞/微球结合特性与仪器的配置结合起来考虑。由于细胞的使用和仪器信号输出的潜在漂移，检测的接受标准可能比其他基于非流式细胞术的LBA方法更宽泛。了解这些局限性，特别是使用流式细胞术进行分析验证及长期检测时更有利。流式细胞术用于免疫原性检测的要点在于试剂的偶联、细胞的选择、数据的输出方式选择、确定合适的阈值以及如何用阈值来判定阳性/阴性。大量的荧光染料都可以用于检测试剂（抗体、可溶性受体、药物、配体或酶，可能是完整分子也可能是功能片段）的偶联，在免疫原性检测中可以直接标记试剂或者使用间接标记的二级抗体来检测。但最重要的是试剂的结合活性以及是否可以支持长期的检测。通常都选择直接用荧光染料标记药物来结合细胞表面的蛋白，在特殊情况下也会考虑对特定位点的定向标记，以避免偶联后结合功能的丢失，其中要注意中和抗体会抑制其结合作用。另一方面，免疫原性的检测试剂在偶联时要注意摩尔耦合比（molar coupling ratios，MCRs），它会直接影响试剂与靶点的亲和力。因此要对不同耦合比例的试剂与未耦合试剂进行比较，明确其结合活性的差异、评估染料的掺入水平和检测性能。通常NAb的检测信号是下降的，但如果药物的作用模式会导致信号下降，那么中和活性则会使信号升高，彼此是一个竞争抑制的关系。用于免疫原性测定的相关细胞系与生物治疗产品的PK研究中对细胞系的要求是一样的，比如对于细胞因子类的药物，一般会选择细胞因子依赖的细胞株，在检测中可以避免干扰。细胞在培养中的状态变化往往是微妙的，随着代次的增加对实验产生的影响也需要仔细评估。图7中是对细胞融合状态下结合和抑制的比较以及不同培养代次对对抑制率的影响。可以看到对于药物与细胞的结合，细胞融合状态的变化对几何平均荧光强度 （GFMI）是有明显影响的。不同代次的细胞对强阳性和弱阳性对照的抑制率的变化有一定的波动，尤其是对于弱阳性对照更明显，但对于检测阳性对照（PC）抑制率是没有影响的。另外，GFMI还非常容易受到仪器性能的影响，这种变化在不同仪器之间可能会高达50%，因而通常会选择计算抑制百分比。图7 细胞融合状态下结合和抑制的比较以及不同培养代次对对抑制率的影响[2]在流式细胞仪上的数据输出可以是MFI或GMFI和以此计算出的抑制百分比 （1-sample signal / max signal）×100或最大信号百分比（sample signal / max signal）×100，如需要可以扣除背景信号。不管使用那一种算法都必须使用分析阈值对样品进行判定。免疫原性检测通常是半定量的，对于检测中和活性的阈值通常设为使用未经治疗的患者人群或正常群体的单侧95%或99%置信区间来区分样品的中和活性阳性和阴性。如果在试验供体中观察到反应的高变异性，则可以在一定限度内评价稀释的试验基质，以使试验灵敏度不受影响。如果用空白供体血清建立的供体间阈值显示出的供体间变异过多，且不能通过进一步稀释供体基质来克服，那么就要采取第三种方法，即在10~20个特定人群血清中加入一定浓度的PC，该浓度PC能够产生1.5~2倍的抑制作用，将这些加药血清与未加药血清一起在NAb试验中进行检测，所得结果可用于计算该供体人群的后/前比值，从被测人群中获得的最低后/前比率可以用作分析的阈值。对于生物基质产生的对阈值的干扰会出现两种情况，如果样品有非特异性活性干扰物，在分析中其响应值高于基质干扰分析的阈值；如果样本中含有药物特异性干扰物且缺乏任何混杂的非特异性因子，则其响应值应低于基质干扰分析的阈值。此时需要在没有添加药物或配体的情况下，比较基质/样品对细胞的影响。对于中和抗体检测中出现的基质干扰可以参考图8的策略。
图8 用于检测药物特异性中和抗体的基质干扰试验的类型[7]
免疫原性验证的要求可以参考相关法规对免疫原性方法验证的要求。见图9 。生物标志物的检测取决于生物标志物的特点以及检测的预期用途，在药物的临床生物分析中主要有免疫细胞的分型检测以及受体占位分析。使用流式细胞术对外周血白细胞异常的表征在自体免疫、肿瘤、心血管和代谢疾病等治疗领域都有应用。白细胞异常可能是某一特定细胞类型丰度的变化，也可能是某一特定细胞类型受体表达的变化。这些细胞生物标志物是慢性、全身性炎症或疾病的特异性生物标志物。在免疫调节治疗的临床试验中监测这些细胞的异常状况可作为疾病发病机制中的生物标志物。对于流式细胞术在免疫表型分型检测中的要点在于目标群体的表征与多参数分析的准确性。对目标群的表征依赖于在同一分析中识别并确定多种表面抗原的表达。如，针对CD20+ B细胞的治疗系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎（RA）的药物。CD20在大多数B细胞淋巴瘤和所有正常B细胞上均有表达，但早期祖细胞和终末分化浆细胞除外。抗CD20治疗导致外周血中B细胞的短暂耗竭。假设用CD20靶向化合物治疗会导致自身反应性B细胞的耗竭，而免疫系统的其他部分完好无损。在针对CD20的细胞毒性嵌合单克隆抗体利妥昔单抗（rituximab）的初步研究中，需要针对目标细胞群进行分析，那么首先是识别目标细胞群，其次是表征目标细胞群的变化（数量或抗原），这需要在一个样本中同时处理大量数据，那么在荧光染料的选择上不仅要考虑仪器的激光与滤光片，还需要考虑后期荧光补偿。现在市面上有很多已经配比好的针对常规血细胞分型染料可供选择。原则上，使用的荧光标记种类越多，可检测的信息就越多，可以将细胞亚群分得更加精细。在流式细胞图中通常都是双参数图，常规7色分析会用到2-2参数图21个组合，10色就会上升到40多个，24色就会到达276个组合图，一般来说8色以上就可称为高维流式分析。这时候手动分析不仅难度大，误差也会随着设门逻辑而放大，同一个人设门策略的改变也会出现显著的实验误差。有文献研究了一对标记及其设门逻辑顺序对NK bright和CD161 DC的影响（如图10），其变异性很高。改变2-2参数配对的顺序不仅会导致细胞数量的变化，而且会导致门中细胞群的部分重叠，门控误差主要是由较大的群体对较小的群体的掩盖造成的。因此，为了提高人工门控的可靠性，应该优先选择在频繁表达的标记之前显示特定标记的策略。另一方面要加强标准化的分析流程，可以借助基于算法的多参数分析工具来完成（图11），如Cytobank。图11 基于算法的多参数分析方法[Beckman]受体占位（Receptor occupancy ，RO）分析是指导临床前和早期临床活动剂量设置的关键，来自RO评估的信息用于生成综合PK/PD模型，以确定所研究药物的浓度-效应关系和剂量-效应-时间分布，有助于建立生物治疗剂的最小生物效应水平（Minimal Biological Effect Level，MABEL），并建立最佳的剂量和给药方案以及安全性评估和确定适当的受试者随访时间。流式细胞术是检测受体占位率（%RO）的最佳手段。RO评估有两种基本模式。一种是评估未占用（未结合）位点比例的间接方法，使用标记荧光的药物分子与药物分子竞争结合靶点，称之为“free”（图12中分析模式1）。第二种方法是使用识别药物分子的荧光标记二抗直接评估结合药物的水平（图12中分析模式2），称为“bound”。这两种方法都可以用来评估阳性细胞相对于背景对照（如无荧光对照、同型对照）的比率，或者测量受体表达的荧光强度MFI（mean或median）。RO试验已经在临床前和临床开发中使用，并延续到临床III期和上市后的研究，说明了其在药物开发过程中的重要性和实用性。RO分析“free”分析模式的评估是迄今为止主要使用的模式。检测看上去相对简单，但事实并非如此。“free”分析由两个测试来完成，Tube 1是待测样本+标记药物，Tube 2是待测样本+过量药物+标记药物，用于评估背景；“bound”分析包含两个管。Tube 3是测试样本+标记的二抗，Tube 4是测试样本+过量药物+标记的二抗，用于确定总受体。从这些测量中可以计算出游离受体的百分比（% free）和结合受体的百分比（% bound），如图13。虽然这两种试验都可评估受体占位率，但都有其固有的优缺点。“free”需要预实验来建立总受体水平的参考点。如果总受体水平在剂量设置后发生变化（如受体的内化、脱落或上调），该分析得出的%RO会过高或过低。另外，“free”检测可以通过非竞争性抗体来检测总受体表达的变化，但是由于抗体试剂之间的各种生物物理性质（如不同的荧光染料、荧光染料与蛋白质的偶联比、抗体结合特性等）的差异，非竞争性抗体只能检测总受体表达比例，而不能建立总水平的参考点。相比之下，“bound”测定中总受体水平的参考点是在同一样本中评估的，所测的结合%RO不受试验过程中总受体表达变化的影响。如果假设抗药二抗的背景结合在一段时间内保持不变，也可以用结合%RO的预剂量评估来补充分析，以建立一个背景值，可用于高背景的规范化计算校正，参考图13中的公式4。%RO计算的基本原理是基于精密度和准确度评估，当两种方法中的一种比另一种有更好的总体性能时，要考虑到差异。如果% free[公式1]的性能明显优于% bound[公式2]，则应该只考虑使用% free来确定%RO，反之亦然。如果% free和% bound在整个浓度范围内的精度和准确度相似，则可以使用% bound和% free的算术平均值来表示RO[公式5]。如果% bound在较低浓度范围内的准确度优于% free范围，则应考虑使用加权函数[公式6]。相反的，如果% bound在较高浓度范围内具有较好的准确性，而% free在较低浓度范围内有较好的准确性，应考虑[公式7]中的加权函数。在实际数据分析中，可以利用两种模式分析各自的优点来计算RO，并随着动态范围的增加而建立更精确的RO评估。可使得从I期剂量增加试验得到的临床数据有更可靠的解释，以及对II期研究的模型预测更有利。当然是否有必要花费如此长的时间来获取RO信息还存在争议。大多数报道的研究只实现了两种检测模式中的一种，并且通常是“free”。尽管PD生物标志物和探索性生物标志物验证中很多条款不适用，但还是尽可能去验证准确度、精密度、灵敏度、特异性、可报告范围、相互作用和功能性特点。图14中给出了表型方法验证的建议，图15给出了功能方法验证的建议。验证的程度取决于分析方法和数据的预期用途。
流式细胞术的数据输出取决于所研究系统的生物学特性、所提出的具体科学问题以及结果的预期用途，因此流式细胞术的方法验证更具挑战性。这些挑战与细胞、试剂、细胞参考物质缺乏和仪器的复杂性等有关。虽然针对流式细胞术“fit-for-purpose”的方法学验证指南还需要更多的讨论，以达成一致意见，但与LBA法和质谱法相比，流式细胞术对单细胞的精准分析，已经成为生物治疗药物研发与细胞治疗产业中必不可少的分析工具。它不仅能够同时进行多个参数的检测，还能够以不同的方式灵活地报告数据。随着流式细胞术在生物治疗药物研发和细胞治疗领域的广泛应用，必将提高生物医药相关检测高通量、多维度分析的可行性，在医药研发过程中提供更精准、更具临床相关性的参考数据，为药物研发作出更大贡献。特别声明：本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊，官方网络报道等公开渠道，不涉及任何保密信息。
参考文献
[1] Litwin V, Marder P. Flow Cytometry in Drug Discovery and Development [B]. John Wiley & Sons, Inc. 2011, NJ, USA.
[2] G.A. Parker (ed.), Immunopathology in Toxicology and Drug Development, Molecular and Integrative Toxicology[B], Springer International Publishing AG 2017.
[3] Jennifer J. Stewart, Cherie L. Green, Nicholas Jones, et al. Role of Receptor Occupancy Assays by Flow Cytometry in Drug Development [J]. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 2016, 90B:110-116.
[4] F.Gondois-Rey, S.Granjeaud, P.Rouillier, et al. Multi-Parametric Cytometry From a Complex Cellular Sample: Improvements and Limits of Manual Versus Computational-Based Interactive Analyses [J]. Cytometry Part A. 2016, 89A: 480-490.
[5] Jo Cunliffe, Nicola Derbyshire, Sue Keeler, et al. An Approach to the Validation of Flow Cytometry Methods [J]. Pharmaceutical Research. 2009, 26(12): 2551-2557.
[6] Vellalore N Kakkanaiah, Kevin R Lang, Patrick K Bennett. Flow cytometry in cell-based pharmacokinetics or cellular kinetics in adoptive cell therapy [J]. Bioanalysis. 2018, ISSN 1757-6180.
[7] Shalini Gupta a, Stephen R. Indelicato, Vijay Jethwa, et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics [J]. Journal of Immunological Methods. 2007, 321: 1-18.
[8] Ola Sternebring, Lene Alifrangis, Toke Folke Christensen, et al. A Weighted Method for Estimation of Receptor Occupancy for Pharmacodynamic Measurements in Drug Development [J]. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 2016, 90B: 220-229.
[9] Denise M. O'Hara, Yuanxin Xu, Zhiyan Liang, et al. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays [J]. Journal of Immunological Methods. 2011, 363: 120-134.
[10] Cherie L. Green, Jennifer J. Stewart, Carl-Magnus Hogerkorp, et al. Recommendations for the Development and Validation of Flow Cytometry-Based Receptor Occupancy Assays [J]. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 2016, 90B:141-149.
[11] Wayne A. Colburn, Jean W. Lee. Biomarkers,Validation and Pharmacokinetic-Pharmacodynamic Modelling [J]. Clin Pharmacokinet. 2003, 42(12): 997-1022.
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