理研、坂大等发现受精卵维持精子染色体的结构
理化学研究所、大阪大学等的研究小组发现，哺乳类受精卵中有防止精子染色体与多余的卵子染色体一起释放到外面的2个阶段的结构。 成果有可能有助于提高显微受精等不育治疗技术。 受精卵是从父母那里每次继承一套基因组(全部遗传信息)，拥有两套的“二倍体”，在发生中基本维持这一点。 不过，哺乳动物中，由于染色体数量父子相同，处于减半“减数分裂”途中的二倍体卵子与减数分裂结束的单倍体精子融合，受精卵暂时成为三倍体。 卵子一侧多余的染色体在受精后释放。 这个时候，精子染色体没有被牵连释放，而是留在受精卵中的结构是个谜。 因此，研究小组调查了小鼠精子和卵子染色体的详细行为。 结果首先表明，精子在卵子染色体附近不能受精。 受精中，为了精子和卵子的细胞膜粘合，卵子细胞膜上的两种蛋白质是必要的。 研究由这些组成的“朱诺结构体”，发现它们不在卵子染色体附近，而是聚集在远离的另一侧。 卵子控制着朱诺结构体的存在范围，使精子远离卵子染色体，不在附近受精。
卵子染色体附近没有发生受精(左、中央)。 右边是荧光显微镜图像，两种蛋白质生成的朱诺结构体(黄色)集中在远离卵子染色体(浅蓝色)的部分(由理化研究所提供)
受精后，精子染色体即使移动也决不会接近卵子染色体。 为了探索其结构，破坏了保持细胞形状的骨骼角色“肌动蛋白结构体”，结果产生了卵子染色体和精子染色体接近、融合的东西。 由此发现肌动蛋白结构体使两者远离。
不接近卵子染色体(上面浅蓝色的块)而移动的精子染色体(黄色箭头的前端)的连续照片(理化研究所提供)
从一系列的结果中可以看出(1)卵子控制着朱诺结构体，使卵子染色体附近不发生受精，(2)受精后肌动蛋白结构体使精子染色体经常远离卵子染色体，从而避免精子染色体的释放。 另外，利用人类不育治疗使用的显微受精法( ICSI )，故意将精子染色体放入卵子染色体附近制造受精卵，结果约有30%的精子染色体与卵子染色体融合后被释放。 研究小组的坂大微生物病研究所教授伊川正人(生殖生物学)表示:“根据显微授精法，有必要将精子染色体放置在远离卵子染色体的地方吧。 如果显微授精的效率这样提高，不育治疗应该会变得安心、安全吧。” 哺乳类的卵子一般不耐光，所以很难用激光照射进行分析。 因此，研究小组确立了使用高灵敏度照相机抑制激光输出进行观察的方法，取得了这次的成果。 研究小组由理研生命机能科学研究中心的森雅志研究员(发生生物学)等、坂大的伊川教授，以及近畿大学、扶桑药品工业、国立遗传学研究所的研究者组成。 成果刊登在8月23日的美国细胞生物学杂志《细胞生物学期刊》上，理研等在9月2日发表。
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理化学研究所等的新闻发布会“不要抛弃精子DNA，发现受精卵中精子染色体的释放防止机构”不要扔掉精子DNA - -发现受精卵中精子染色体的释放防止机制-理化学研究所(理研)生命机能科学研究中心染色体分配研究小组的森雅志研究员、北岛智也小组组长、大阪大学微生物病研究所的伊川正人教授等组成的联合研究小组利用小鼠控制受精卵中精子[1]染色体的细胞内定位，与多余的卵子[1]染色体一起极体[2] 本研究成果将提供哺乳类受精的基础知识，同时也将对显微受精( ICSI )法[3]等不育治疗技术的提高和效率做出贡献。 哺乳类受精时，减数分裂[2]途中停止的二倍体[4]的卵子和减数分裂完成的单倍体[4]的精子融合，暂时生成三倍体[4]的受精卵。 卵子侧多余的染色体在受精后发生的减数分裂完成后释放到极体上，但是此时精子的染色体为什么不一起释放，也就是说“不能丢弃”还不清楚。 此次，联合研究小组分析了小鼠受精过程中精子和卵子染色体的详细行为，表明精子染色体的定位受到控制，总是与卵子染色体保持距离。 另外，如果精子人为定位在卵子染色体附近，精子染色体会从受精胚被丢弃到极体中，因此发现了该调控机制对于正常发生是必要的。 本研究刊登在科学杂志《小区日报》在线版( 8月23日)上。以与卵子染色体保持距离的方式移动的受精后不久的精子染色体(箭头)背景 卵子和精子融合产生的受精卵从母亲和父亲那里各继承一套基因组[4]，共计保持两套的二倍体。 受精卵正常发生需要正确维持二倍体，如果受精卵破裂，会导致流产和出生异常。 但是已知哺乳类的受精后不久的受精卵一时成为保持3组基因组DNA的3倍体(图1 )。 这是因为精子是减数分裂完成的单倍体，而成熟卵子是减数第二分裂中期停止细胞周期的二倍体，通过它们的融合形成三倍体。 受精后，卵子的染色体由纺锤体分配，一套基因组由女儿细胞的一方(受精卵一侧)继承，另一套释放到另一个女儿细胞(极体)。 此时，一套精子染色体必须保持在受精卵一侧(图1 )。图1哺乳类受精和倍数性的变化 哺乳类受精时，精子基因组为1套( 1n )，但卵子在减数第二分裂中期停止，卵子基因组在细胞膜正下方直接排列2套( 2n )。 在这种状态下受精后，会暂时变成三倍体，之后只有一组卵子基因组释放到极体中，成为可能发生的二倍体。迄今为止哺乳类的受精过程主要使用固定的受精卵进行了分析。 但是用这种方法，虽然可以比较不同时期多个受精卵的情况，但是很难正确捕捉到细胞的连续变化。 因此，三倍体受精卵确实向二倍体转移的机制尚不清楚。研究方法和成果 哺乳类的卵子不会从体内释放到外界，一般具有不耐光刺激的性质。 特别是小鼠精子和卵子的细胞融合光敏感性高，因此难以使用需要激光照射的荧光标记，经时且立体地分析受精过程。 联合研究小组通过在检测器方面使用高灵敏度摄像机，确立了抑制激光输出的小鼠受精过程的实时成像法[5]，成功地连续分析了卵子及精子染色体的行为。 利用这个方法，得到了下述新的见解。 首先，用实时成像法观察精子和卵子融合的过程，发现精子在卵子染色体附近不能受精(图2左、中央)。 受精是通过精子和卵子的细胞膜粘接、融合而成立的。 已知精子和卵子的粘附需要卵子细胞膜中存在的两种膜蛋白Juno[6]和CD9[6]。 于是，我们观察了Juno蛋白质的定位，发现卵子细胞膜上有强定位、弱定位、非定位三种模式。 具体来说，Juno和CD9聚集的点状结构体( Juno结构体)的存在仅限于卵子染色体的另一侧半球及其附近，在卵子染色体附近没有观察到Juno结构体(图2右)。 详细的分析结果表明，在卵子染色体附近，Juno结构体的形成受到阻碍，从而控制精子的融合场所。图2精子融合地点的控制 左)利用实时成像法观察小鼠卵子染色体的位置和精子的融合区域，作为连接卵子中心和卵子染色体的直线的角度测量了这些位置关系。 中)受精场所的测量数据。 点表示受精卵。 如果卵子染色体的位置为0度，则没有卵子染色体附近的40度以内受精的例子。 右)小鼠卵子的荧光显微镜观察图像。 受精所需膜蛋白Juno (红色)和CD9 (绿色)形成的点状结构体( Juno结构体，黄色)集中在卵子染色体的另一侧半球，无法在卵子染色体附近形成。 标尺为20微米( μm，1μm为1，000分之1mm )。其次，观察了精子融合后染色体的行为。 结果表明，精子染色体从融合的地方发生了很大的局部变化，但不移动到卵子染色体附近，卵子染色体和精子染色体不接近。 已知细胞内结构物的移动受细胞骨架的控制。 于是，用细胞骨架之一的肌动蛋白纤维[7]的聚合抑制剂处理受精卵时，观察到卵子和精子染色体接近，结合成一团染色体组。 由此表明，肌动蛋白结构物[7]对于防止接近是必要的。 最后，观察了用人类不育治疗使用的显微受精( ICSI )法人工受精的小鼠受精卵中染色体的行为。 人为制造了精子染色体定位在卵子染色体附近的受精卵时，发现精子染色体在很多情况下会被丢弃到极体上(图3 )。 由此表明，本研究发现的两个机制控制精子染色体的定位，即控制精子融合场所和控制精子染色体在细胞内的移动，是防止精子染色体极体释放所必需的。图3注入卵子染色体附近的精子染色体的行为 如果用显微受精法将小鼠精子强制注入卵子染色体附近，约30%的受精卵将精子染色体丢弃在极体上。今后的期待 本研究成功地揭示了哺乳类受精后不久的3倍体受精卵确实向2倍体转移的机制的一部分。 这次共同研究小组确立的受精过程的实时成像法，有望成为推进该领域研究的有用的研究方法。 另一方面，研究表明，如果将精子强制注入卵子染色体附近，则有很高的几率被极体“抛弃”。 由此推测，在不育治疗中使用的显微受精法中，精子的注入场所需要适当控制。 今后有必要利用人类卵子进行同样的研究，开发出使精子染色体确实定位在远离卵子染色体的地方的方法。补充说明 1 .精子、卵子 可受精的雌性生殖细胞称为卵子。 卵子在减数第二分裂的途中细胞分裂停止，是保持两套基因组的二倍体。 另一方面，可受精的雄性生殖细胞称为精子。 精子已经完成减数分裂，是保持一套基因组的单倍体。 2 .极体、减数分裂 在真核生物的生殖器官(精巢和卵巢)的生殖细胞中看到的，用于生成配子(精子和卵子)的特殊样式的细胞分裂称为减数分裂。 中途DNA不被复制，发生2次细胞分裂(减数第一分裂、减数第二分裂)。 卵母细胞减数分裂生成成熟的卵子时，由于显着的不对称分裂，产生了不成卵子的小女儿细胞。 将其称为极体。 3 .显微受精( ICSI )法 用于不孕症治疗的体外受精方法之一。 是用玻璃针将精子头部注入卵子的方法，是省略精子和卵子融合过程的手段。 ICSI是Intracytoplasmic sperm injection的缩写。 4.2倍体、1倍体、3倍体、基因组 基因组是指每个生物种类特有的遗传信息( DNA序列)的总体。 将保持两组基因组的细胞称为二倍体，将保持一组的细胞称为单倍体，将保持三组的细胞称为三倍体。 普通的体细胞是从父方和母方各继承一套基因组，共保留两套的二倍体。 生殖细胞经过减数分裂，最终形成单倍体。 5 .实时成像法 隔开一定间隔拍摄活细胞(卵子和精子)，随时间观察细胞变化的方法。 本研究利用荧光标记使染色体特异性可视化，并分析了染色体定位随时间的变化。 6.Juno、CD9 存在于卵子细胞膜中的受精所需的膜蛋白。 Juno作为精子侧膜蛋白IZUMO1的受体发挥作用。 CD9被认为能促进Juno和IZUMO1的结合。 7 .丝切蛋白纤维、丝切蛋白结构物 丝切蛋白蛋白质聚合而成的丝状聚合物称为丝切蛋白纤维，是主要的细胞骨架成分之一。 丝切蛋白纤维与结合蛋白质相互作用而组织化的物质称为丝切蛋白结构体。
联合研究小组 理化学研究所生命机能科学研究中心 染色体分配研究小组 研究员森雅志 队长北岛智也 基础科学特别研究员三品达平 超微形态研究小组 队长米村重信 技术人员(研究当时)远藤广美(远藤广美) 大阪大学微生物病研究所遗传信息实验中心基因功能分析领域 教授伊川正人 近畿大学生物理工学部 教授山县一夫 大学生米泽直央 扶桑药品工业株式会社研究开发中心 高级研究员八尾龙马 国立遗传学研究所物理细胞生物学研究室 准教授岛本勇太 博士研究员田中真仁
研究支援 本研究由理化学研究所运营费补助金(生命机能科学研究)实施，日本学术振兴会( JSPS )科学研究费补助金青年研究( a )“哺乳类受精的二倍体维持机构(研究代表者:森雅志)”新学术领域研究(研究领域提案型)“支配受精卵全能性的基因组的分离和功能解析( 2000 ) 以及内藤纪念科学振兴财团研究资助“受精过程中精子染色体极体释放抑制机构(研究代表者:森雅志)”等资助进行原论文信息Masashi Mori*, Tatsuma Yao, Tappei Mishina, Hiromi Endoh, Masahito Tanaka, Nao Yonezawa, Yuta Shimamoto, Shigenobu Yonemura, Kazuo Yamagata, Tomoya S. Kitajima, Masahito Ikawa*, "RanGTP and the actin cytoskeleton keep paternal and maternal chromosomes apart during fertilization", Journal of Cell Biology, 10.1083/jcb.202012001
发表者物理化学研究所生命功能科学研究中心染色体分配研究小组研究员森雅志队长北岛智也大阪大学微生物病研究所教授伊川正人
联合研究小组 理化学研究所生命机能科学研究中心 染色体分配研究小组 研究员森雅志 队长北岛智也 基础科学特别研究员三品达平 超微形态研究小组 队长米村重信 技术人员(研究当时)远藤广美(远藤广美) 大阪大学微生物病研究所遗传信息实验中心基因功能分析领域 教授伊川正人 近畿大学生物理工学部 教授山县一夫 大学生米泽直央 扶桑药品工业株式会社研究开发中心 高级研究员八尾龙马 国立遗传学研究所物理细胞生物学研究室 准教授岛本勇太 博士研究员田中真仁
