Prkdc基因及其在NHEJ中的作用
今天我们要讲的主角是编码了NHEJ通路中关键蛋白DNA-PKcs的Prkdc基因。
基因基本信息
Prkdc编码的DNA-PKcs
DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PK）是一个由DNA激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，大量表达在几乎所有哺乳动物的细胞中。DNA-PK是DNA修复的关键蛋白激酶，参与了非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。此外，DNA-PK也参与了基因的转录调控等过程[1]。DNA-PK由3个亚基组成：Ku80、Ku70和DNK-PKcs（图1）。其中，XRCC5基因编码了Ku80，XRCC6基因编码了Ku70，而Prkdc基因编码了DNK-PK的催化亚基（DNA-PKcs）。DNA-PKcs 能被分为三个大型结构单位：一个N端螺旋结构域（N-terminal arm），一个含有多种HEAT（Huntingtin, Elongation Factor 3, PP2A和TOR1）重复序列和大量保守的磷酸化簇的圆形摇篮结构域（circular cradle），以及一个含有高度保守的激酶结构域（kinase）的C端结构域（C-terminal head）。
图1. DNA-PK的结构[2]
A）Ku80显示为黄色，Ku70显示为绿色，DNA-PKcs显示为彩色。Ku70和Ku80的核心（core）形成与DNA结合的Ku异二聚体，如图B所示。Ku80CTR和Ku70CTR代表了两个蛋白的C端区域（C-terminal regions，CTR）。与DNA-PKcs互相作用的C端区域显示为黑色。
B）上图：与DNA结合的Ku70/80的晶体结构(PDB code: 1JEY) 。下图：Ku80CTR球状结构域（globular domain）的核磁共振结构(PDB code: 1Q2Z) 。
C) DNA-PKcs的晶体结构(PDB code: 5LUQ)，着色方案与图A对应。Head包括FAT (FRAP, ATM, TRRAP), FRB(FKBP12-rapamycin-binding), kinase和FATC (FAT C-terminal) 结构域。Ku80CTR的三个螺旋结构显示为黑色。
DNA-PKcs 参与了NHEJ
DNA的双链断裂（double-strand breaks，DSBs）是最严重的一种DNA损伤，可由多种内源性因素（例如V（D）J重排），或外源性因素引起（例如电离辐射）。如果不能被修复，DSBs可能会引起同源染色体断裂和细胞死亡[3]。DSBs主要通过两种方式进行修复：同源重组(homologous recombination，HR）和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。细胞周期是影响DSBs修复机制的主要因素：HR修复需要DNA复制时姐妹染色单体上的同源序列的存在，以此为模板指导修复的精确进行。因此，HR修复是精确的（error-free），主要发生在细胞周期（cell cycle）中的S期。而NHEJ修复不需要借助同源模板链的帮助，NHEJ机制中的修复蛋白直接将双链断裂的末端拉近距离，再由DNA连接酶（ligase）将断裂处连接。因此，NHEJ是快速但不精准的（error-prone），在整个细胞周期中都能起作用（主要是是G1和G2期）。
在NHEJ中，Ku70与Ku80能在断裂的DNA末端迅速组装成Ku异二聚体，招募并激活DNA-PKcs，而Artemis核酸酶被DNA-PKcs磷酸化后，能打开DNA发夹中间体，然后由XLF，Ligase IV和XRCC4d 复合物催化再连接（图2A）。特别地，NHEJ机制也存在于T、B 细胞的 T 细胞抗原受体（TCR）、B 细胞抗原受体（BCR）基因的V（D）J重排中。在这里，DSBs是由重组酶Rag1和Rag2识别并剪切V（D）J片段相邻的重组信号序列（recombination signal sequence，RSS）造成的。其中，Rag1和Rag2、Ku70和80、XRCC4和Ligase IV是信号序列连接（signal join）和编码序列连接（coding join）所必需的；而DNA-PKcs 和Artemis则是编码序列连接所必需的（图2B）。此外，缺乏不同V（D）J重组所需蛋白质的小鼠也展示出不同表型（表1）。
图2. NHEJ通路[4]
(A) 辐照等造成的DNA双链断裂（DSBs）。括号表示不同细胞类型可能表现出不同程度的对Artemis和DNA-PKcs的依赖性。
(B) V（D）J重排造成的DNA双链断裂（DSBs）。PSC：剪切后突触复合体（postcleavage synaptic complex）。
表1. 缺乏V（D）J重组所需蛋白质的各种小鼠表型[4]
DNA-PKcs 与肿瘤
DNA-PKcs是NHEJ途径的关键组成部分，也是一种潜在的癌症治疗靶标。我们可以通过抑制DNA-PKcs活性，使肿瘤细胞对电离辐射（IR）和DSB诱导剂敏感，从而提高放疗和化疗效果。目前，已有多种小分子DNA-PKcs抑制剂。例如，Willoughby等人发现NU5455，小分子DNA-PKcs抑制剂，能有效增强对肺癌定向放疗和对肝细胞癌局部化疗的治疗指数（therapeutic index）[5]。
图3. 小分子DNA-PKcs抑制剂NU5455[5]
小结
Prkdc基因编码了DNA蛋白激酶的催化亚基（DNA-PKcs），DNA-PKcs作为NHEJ途径中的关键组成部分，在维持基因组完整性上起到了重要作用。带有PrkdcSCID突变的SCID小鼠由于DNA-PKcs缺陷，V（D）J重排受阻，因此缺乏功能性T、B细胞。但同时，随着年龄增长，SCID小鼠也可能产生免疫泄露（leakiness），即小鼠体内产生少量的有功能的T、B细胞和免疫球蛋白。目前，这种免疫泄露的分子机制仍不明确，且不同遗传背景的SCID小鼠中的免疫泄露发生率不同：一般来说，SCID小鼠在C57BL/6J 和BALB/c 背景上的泄漏率高；在C3H背景上较低；而在NOD背景上极低。