土鳖虫提取液对人胃低分化腺癌细胞BGC
《中国药典》收载土鳖虫正品药材为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳖Steleophage plancyi (Boleny)的雌虫干燥体，性寒，味咸，有小毒。目前治疗消化道肿瘤的中医处方中土鳖虫的应用非常广泛，大多入中药复方煎取，认为其有抗肿瘤活性。然而，土鳖虫的抗肿瘤作用及其抗肿瘤成分未见有明确的实验室研究报道。笔者对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料来源 实验细胞株：人胃低分化腺癌BGC823细胞株为本实验室常规培养，生长于含10%新生牛血清的RPMI1640完全培养液中，37℃恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中生长。取对数生长期细胞用于实验。土鳖虫：购自六安市国泰药业有限责任公司，批号：20041201试剂：RPMI1640培养液(GIBCO公司产品)；MTT(sigma公司产品，以超纯水配制成5 mg/ml浓度)；二甲基亚砜（DMSO，上海凌峰公司产品，分析纯）。
1.2 药物制备
1.2.1 水提物的制备称取药材100 g，以水为溶媒提取两次。第1次加10倍量水，加热提取1 h，滤过；药渣加8倍量水，加热提取1 h，滤过。合并两次滤液，浓缩至1 g/ml（相当于生药），定容。0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
1.2.2 醇提物的制备称取药材300 g，以95%乙醇为溶媒提取两次。第1次加8倍量溶媒，加热提取1 h，滤过；药渣加8倍量溶媒，加热提取1 h，滤过。合并两次滤液，浓缩至1 g/ml（相当于生药），定容。0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
1.2.3 配药将上药用完全培养液稀释后得4种终浓度：10，5 ，2.5，1.25 mg/ml供实验用。将醇提液原液以完全培养液稀释为8，7.5 ，6，5 ，4 ，3 ，2，1 mg/ml供实验用。以上药物均实验前新鲜配用。
1.3 方法与步骤
1.3.1 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)显色法［1，2］在含10%胎牛血清的1640培养液中培养细胞，在细胞达到指数增长期时用于实验。记数细胞浓度为2.5×104/ml，接种于无菌的96孔培养板中。每孔加入肿瘤细胞悬液200 μl，培养24 h后吸去原有的培养液，分别加入各200 μl的4种不同浓度土鳖虫醇提液和6种不同浓度水提液，设空白对照孔加完全培养液，实验对照孔加肿瘤细胞，每组均为5复孔。混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。于结束前4 h每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml MTT，继续培养4 h后吸去全部上清液，每孔加入二甲基亚砜200 μl溶解液，微型混合器振荡10～15 min，充分溶解，用酶联免疫检测仪于490/620 nm波长处测定光密度OD值，按抑制率计算公式计算抑制胃癌细胞的百分率。
1.3.2 确定最佳药物浓度用上述方法得出土鳖虫醇提液药不同浓度对胃癌细胞的作用，选取的不同药物作用浓度分别为：8，7.5 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2，1 mg/ml。
1.3.3 确定最佳药物作用时间用上述方法得出土鳖虫醇提液药不同时间对胃癌细胞的作用，选取的不同药物作用时间分别为: 8，18，24，30，48，72 h。
1.4 肿瘤细胞抑瘤率计算公式抑瘤率=1-(OD实验组-OD空白组) /(OD实验对照组-OD空白组)×100%
2 结果
2.1 土鳖虫醇提液和水提液的抑制细胞作用比较水提液各组抑制率均为负数。而醇提液组10 mg/ml组抑制率为91.87％，5 mg/ml组抑制率为72.56％，2.5 mg/ml组抑制率为24.57％，1.25 mg/ml组抑制率为3.23％，而1％浓度的乙醇的抑制率为-4.68％。结果见图1。
图1 土鳖虫醇提液和水提液的抑制细胞作用比较（略）
2.2 不同浓度土鳖虫醇提液抑制细胞作用比较加药后培养24 h时抑制率自低浓度到高浓度逐渐上升，1~2 mg/ml时，没有明显的抗肿瘤作用，5 mg/ml开始，抑瘤率处于较高的水平，8 mg/ml的药物浓度抑瘤率最高。IC50为3～4 mg/ml。结果见表1，图2。
表1 土鳖虫醇提液对体外培养肿瘤细胞的细胞毒作用（略）
2.3 不同时间土鳖虫醇提液抑制细胞作用比较从图中可以看出：加药后培养8 h，即有明显的抗肿瘤作用，并且随着剂量的增加，抑制率逐渐上升，48 h时抑制率处于最高的水平，72 h与48 h并无明显差别。结果见图2。
图2 不同浓度不同时间土鳖虫醇提物的作用曲线（略）
3 讨论
土鳖虫入肝、心、脾三经，专理血症，具有散血淤、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。妇科常用于逐淤通结，内科常用于散结消症，伤科常用于续骨疗伤。其性中和，破而不峻，能行能和，年老体虚者均可用之，是中医临床中血淤证的常用药。始载于《神农本草经》，主“心腹寒热洒洒，血积瘕，破坚，下血闭”。《金要略》、《本草纲目》等历代医药著作中均有记述。《金要略》中该药入方四次，其中三次以丸散入药，在治疗腹中瘕的大黄庶虫丸和鳖甲煎丸中均研末为丸，而非水提液。仅在下淤血汤中入汤剂，治疗经水不利。近十余年有几篇文献都提到了土鳖虫具有抗肿瘤作用，但研究并不深入。比较公认的一点是土鳖虫在体外对白血病细胞有抑制作用［3，4］。另外有人推测土鳖虫中β谷甾醇成分［5］和以油酸为主的不饱和脂肪酸［6］很有可能有抗癌作用。关于土鳖虫抗肿瘤细胞的机制的研究就比较少，田代华［3］认为土鳖虫具有抗突变及抗肿瘤作用，可抑制体外肝癌、胃癌细胞的呼吸，但其理论根据不详。目前治疗肿瘤的中药汤剂中土鳖虫的应用非常广泛。根据我们研究的结果，土鳖虫水提液对于胃癌BGC823和肝癌HePG2细胞并没有抑制作用，相反，有促进肿瘤细胞增长的作用。由此，我们是否可以推想：临床上应用时，如取其抗肿瘤作用，应当改变剂型？本研究采用MTT法对不同浓度土鳖虫醇提物作用下细胞72 h的生长情况进行了观察，结果表明土鳖虫醇提物对细胞生长的抑制成一定浓度的依赖性:当药物浓度较低时，细胞吸光度值无明显变化。最佳药物浓度在8 mg/ml，对胃低分化腺癌有明显的杀伤作用，其抑瘤率达到98.06%。本研究还显示土鳖虫醇提物对细胞生长的抑制成一定时间的依赖性: 土鳖虫醇提物对细胞作用48～72 h抑制作用最强。我们正进一步提取分离其有效部位并研究其抑制作用的机理。