Nature Cancer | 肿瘤异质性和进化研究新利器，同时实现谱系追踪 组学分析
撰文：风不止步
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亮点：
一种功能化谱系追踪系统ClonMapper，将DNA条形码与单细胞RNA测序和克隆分离相结合，可全面表征异质群体中的数千个克隆。使用ClonMapper确定具有不同克隆组成、转录特征和化疗存活轨迹的慢性淋巴细胞白血病细胞系的亚群。在治疗之前、期间和之后检索特定克隆的能力能够直接测量克隆多样化和持久的亚群转录特征。ClonMapper是一种强大的多功能方法，用于剖析肿瘤进展和治疗反应的复杂克隆动力学。
2021年7月12日，美国德克萨斯大学的艾米布洛克副教授等人在《Nature Cancer》上发表了一篇“Multifunctional barcoding with ClonMapper enables high-resolution study of clonal dynamics during tumor evolution and treatment”的文章。作者开发了一个谱系追踪平台 ClonMapper，它将克隆表征与克隆分离的优势结合起来。
到目前为止，克隆进化的研究主要使用大量肿瘤 DNA 测序随时间跟踪变异等位基因频率 (VAF)，但这种方法目前受到测序检测下限的限制。最近以更高规模和分辨率监测克隆动态的努力利用了DNA条形码，它在单个细胞的基因组中引入了独特的遗传标记，以便可以随着时间的推移跟踪它们及其后代。虽然DNA条形码在过去几年已经发展到将克隆身份与单细胞转录组学测量联系起来，但这些方法具有破坏性，因此不允许对感兴趣的特定克隆进行后续的分子和功能分析。尽管存在实现活细胞克隆分离的方法，但许多方法需要大量操作，灵敏度有限或缺乏与单细胞RNA测序整合。在感兴趣的活克隆上系统地识别、分离和执行综合表征（遗传学、表观遗传学、蛋白质组学、活细胞分析）的能力代表了分析动态生物系统复杂相互作用的下一个重大进展。迄今为止，缺乏对复杂生物系统进行克隆剖析的敏感方法限制了我们超越仅仅识别克隆动态模式的能力。
通过将 DNA 条形码与CROP-seq相结合，CROP-seq是一种单向RNA (sgRNA)表达载体，可以在scRNA-seq协议中表达和捕获sgRNA条形码，而 COLBERT 是一种使用条形码 sgRNA 驱动选择性表达的系统。感兴趣的克隆中的荧光报告基因以使其物理隔离（图 1a-c）。因此，该平台通过将克隆身份与单细胞转录组学以及遗传、表观遗传和活细胞特征有效联系起来，允许对复杂进化群体中的克隆进行全面和系统的表征。应用 ClonMapper 来研究慢性淋巴细胞白血病 (CLL)，其典型的惰性动力学为研究克隆进化提供了一个合适的环境。证明这个综合平台能够识别对CLL 模型细胞系的治疗，在初级 CLL 样本中验证这些特征并测量克隆转录组学特性的内在稳定性。
平台的一个关键优势是能够将克隆身份与各自的适应度和转录组学特征联系起来，能够识别一个“HS”克隆子集，与“LS”子集相比，显示出上调的 CXCR4、Wnt 和 Notch 信号。HS和 LS 亚群在治疗后都表现出细胞毒性的直接迹象，然后是长时间的停滞，而不是直接的敏感性或抗性。然而，HS 克隆比 LS 克隆更有活力，并且更快地重新进入增殖状态。这种药物反应和恢复范围不同于耐药性的二元概念，建议“耐受性”的等级（低、中、高）更能代表异源克隆对化疗的可变反应。
（图 2：高存活率和低存活率亚群的特征和临床关联）
（图 3：高存活克隆表现出更高的耐药性）
分离和共培养 HS 和 LS 亚群的能力能够识别可能的细胞间相互作用，从而在大量种群内建立克隆平衡。确定两个群体之间的几个配体-受体对，它们作为细胞通讯的潜在介质，包括几个由LGALS9驱动，LGALS9是CLL中增殖的重要调节剂。进一步检测到与LS和HS特征相关的原代CLL细胞中成对的LGALS9和SORL1表达。数据支持这样一种观点，即随着 LS 细胞的丰度减少，它们的此类配体的分泌减少到低于HS细胞生长不再受到抑制的阈值，从而导致扩增加速。竞争性癌症克隆可以平衡存在，外部扰动可以破坏这种平衡的概念得到了更复杂患者环境中观察的支持，包括在经历“观察和等待”的CLL患者中，其中克隆平衡可以保持数十年治疗的需要扰乱了这种平衡，并导致少数克隆快速生长。进一步认识到，这种细胞间相互作用可能在介导具有异常 CXCR4 表达的其他疾病（包括 Waldenstrom 巨球蛋白血症）的治疗抵抗方面很重要。
因此，直接治疗，可能是持续遗传多样化的结果，从创始祖先 HS 克隆中创造了数千个独特的亚克隆。未来的功能研究将是必要的，以确定特定遗传和/或表观遗传事件与克隆转录特征变化的因果关系。进一步注意到，在复发治疗后的患者中，突变积累的类似趋势很明显，这可能会影响对后续治疗的抵抗力。虽然无法直接断定这种突变负担的增加是否是由治疗的诱变活性特别驱动的，但可以设计使用 ClonMapper 的未来研究来辨别这种因果关系。最终发现为两种力量的平衡带来了定量见解，即积累基因组变异和转录组细胞状态稳定性。总之，它们强调了异质肿瘤群体中发生的遗传和转录组多样化的程度，并作为对癌症巨大进化潜力的来源而非结果的一瞥。
（图 4：启用 ClonMapper 的全基因组测序揭示克隆和亚克隆遗传多样性）
（图 5：克隆在治疗过程中保留了特征性的转录组学特性）
虽然第一个应用是在体外模型细胞系系统的高度受控设置中进行的，但ClonMapper的未来应用可以在原代人和鼠肿瘤模型（例如患者来源的异种移植物或肿瘤同种异体移植物）中利用相同的工作流程来表征影响肿瘤微环境和免疫相互作用对肿瘤进化的影响。研究结果已经突出了癌症人群的多样性，这一特征驱动了巨大的进化潜力，从而使这些复杂的人群非常难以治疗。到目前为止，治疗方法在其针对目标的努力中主要是被动的异质种群，一种反复尝试超越癌症巨大进化潜力的西西弗式努力。看到了新的、积极的策略，如“同质化”，而是旨在通过将不同的癌症人群汇集到同质的、更具靶向性的基因型或表型中来有目的地解决异质性问题。然而，这种方法的实施需要能够系统学习癌症人群适应性和进化轨迹的工具。ClonMapper 等综合工具对于同质化策略的设计和评估至关重要，识别高度耐药亚群及其相应基因表达状态的能力可以为合理有效的靶向策略提供信息。因此，通过将ClonMapper 应用于化疗背景下的克隆动力学研究，对克隆动力学和进化有了深入的了解，可以作为未来发现和开发新治疗策略的模板。
教授介绍
艾米布洛克
生物医学工程副教授
Raymond F. Dawson 百年工程教学奖学金
研究兴趣：癌症系统生物学、异质性和细胞状态可塑性、基因调控网络、化疗耐药、正常分化和分化治疗
研究重点：
实验室将癌症理解为一个复杂的生物系统。
为了获得对该疾病的新见解，应用一种系统方法，将途径集合（基因调控网络）视为细胞状态的决定因素。通过整合来自动态系统、计算科学、微加工和分子细胞生物学的方法，寻求解决肿瘤细胞状态改变和治疗反应的基本问题。
癌症是由正常基因表达程序的失调引起的。表征特定患者肿瘤分子变化的技术在临床中越来越可用，这种类型的分析已用于对肿瘤亚型进行分类。然而，除了肿瘤间异质性之外，还存在大量的肿瘤内异质性。单个肿瘤内的细胞亚群在基因和蛋白质表达、转移潜能和对特定药物治疗的敏感性方面差异很大。
为了有效治疗不断变化的肿瘤细胞群这一“移动目标”，寻求开发有助于识别、监测和预测异质性变化的模型。研究生物反应对定义扰动的动态和变化，以开发合理的个性化疗法。在多个空间尺度上检查这个问题，以揭示细胞间异质性与群体水平对药物治疗的反应之间的关系。
参考文献
1、CatherineGutierrez, Aziz M. Al’Khafaji et al. Multifunctionalbarcoding with ClonMapper enables high-resolution study of clonal dynamicsduring tumor evolution and treatment.(2021)
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