科研 | Circulation：正常小鼠主动脉的单细胞分析揭示了功能不同的内皮细胞群（IF=23.054）
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
血管组织存在于人体所有器官中，参与了组织发育、新陈代谢、炎症等各种生理活动，但对其单细胞的异质性了解甚少。随着基于液滴的大规模并行单细胞测序和分析技术的不断发展，单细胞RNA测序（scRNA）报道了多个小鼠器官中细胞类型的单细胞图谱。然而，血管细胞异质性以及细胞亚群对血管功能的影响尚未报道。本研究利用将小鼠的4条主动脉酶解成单个细胞（>10000个）进行scRNA测序，鉴定细胞亚群并分析相关基因的表达，同时分析了这些细胞对高脂饮食的响应变化。本研究绘制了整个主动脉细胞图谱，通过整合每个细胞中超过1900个基因的表达，更好的表征了主动脉细胞的一致性，为各种血管疾病相关的细胞亚群的研究点奠定了基础。
论文ID
原名：Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations
译名：正常小鼠主动脉的单细胞分析揭示了功能不同的内皮细胞群
期刊：Circulation
IF：23.054（一区）
发表时间：2019.5.31
通讯作者：Rajat Gupta
通讯作者单位：哈佛大学医学院附属布莱根妇女医院
DOI号：10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038362
实验设计
结果
1 正常主动脉的单细胞分布及划分细胞类型的标志物的鉴定
使用基于液滴的大规模平行scRNA测序转录分析了4种野生型C57/BL6小鼠主动脉。以低测序深度（17000 reads/细胞）对2个主动脉进行测序，以高测序深度（145000 reads/细胞）对2个主动脉进行测序。基于测序深度，簇状细胞群体的数量没有差异，所有后续分析使用的是高测序深度数据，大约检测到6200个细胞，每个细胞1900个基因（图1）。在分析之前去除了表达基因计数>4000或<200的细胞。使用每个细胞1100个可变基因的聚类分析来识别具有相似特征的细胞，将细胞利用无监督的方法聚类划分为组（图1B）。在不同簇中代表的血管细胞类型包括內皮細胞EC、血管平滑肌细胞VSMC、动脉成纤维细胞和免疫细胞，以及邻近组织中的神经元簇。检测到制备过程中的少量红细胞，被排除在进一步分析之外。
细胞类型特异性标志物被定义每种细胞簇中表达差异最高的5个基因（图1C），即这些基因在该类型的所有细胞中广泛表达，而在其他簇中不表达。例如VSMC特定标志物是Myh11、TPM2、Myl9、Tagln和Acta2。还鉴定了每种细胞类型中差异倍数的对数> 2的所有基因（图1D）。其中与其他细胞簇相比，单核细胞具有最多的差异表达基因。
进一步划分：第一种标志物在某一细胞簇的所有细胞的>75％中表达，平均标准化表达>0.75，例如Myh11（VSMC）、C1qa（单核细胞）和Pecam1（EC），代表了最特异性和最敏感的标志物。第二种标志物物在细胞簇中差异表达但对此细胞簇的所有细胞不敏感，例如Gpihbp1（ECs）和Cd52/Rac2（单核细胞）。第三种标志物物是在一种细胞簇中高表达但在其他细胞簇中也高表达的基因。
与仅使用少量典型的细胞类型特异性标志物相比，利用所有基因对细胞进行聚类更好的检测细胞亚群和细胞异质性。
2 利用转录组确定主动脉细胞簇的细胞亚群
通过聚类定义的10个独立组定义主动脉细胞类型内的亚群（图2A）。成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞和EC都聚集成多个亚群（图2B），VSMC占所有细胞的39％，聚集成1个亚群，表达典型的VSMC标志物Myh11和Cnn1。成纤维细胞占所有细胞的33％可以分为两个亚组：高表达Pdgfra和胶原蛋白/胶原蛋白结合蛋白（Col1a1，Col1a2，Dcn，Lum）以及低表达与VSMC相关的收缩蛋白（Myh11，Cnn1）。Cdh5为标志物的EC分为3个不同的亚群，但是某些典型的EC特异性基因，例如von Willebrand因子（Vwf）和血管内皮生长因子受体（Flt1，Kdr）在不同亚群中表达差异，不能用作识别主动脉中所有EC的有效标志物。免疫细胞分为3个广泛定义的组：巨噬细胞（H2-Ab1）和2个单核细胞亚群（均表达Lyz2）。基因表达存在重叠，必须使用多种标志物物来区分。一小部分细胞表达了神经元的标志物，包括Mbp和Cnp，可能来自邻近神经元组织的少量污染。其中3个EC簇是离散的亚群，而两个成纤维细胞簇存在连续的梯度变化（图2C）。
之前在大脑的小血管中定义的早期基因标志包括Fos、Fosb、Jun和Junb等在本研究中发现具有相似的表达量，表明其并不是EC和成纤维细胞中细胞异质性的解释。为了探索每个细胞的最小测序reads数，本研究还在深度更低的scRNA测序文库中进行了细胞类型的聚类和鉴定（每个细胞约≈17000个读数），得到数据基本相同。
图2.从单细胞RNA测序鉴定的细胞类型内的亚群。
A，t-随机邻近嵌入（t-SNE）分析得到10个簇。
B，树状图总结了主动脉细胞亚群之间的相似性。
C，鉴定每个细胞亚群的标志物的热图。
3 三个EC亚群具有不同的基因表达谱及不同的功能
ECs是通过典型标志物物Cdh5确定的，用Wilcoxon ranksum分析进一步发现了新的标志物（图3）。包括血管生成中已知的内皮特异性参与者，包括Sdpr、Egfl7、Ptprb和Ecsc以及先前在EC和几种粘附和转运分子（Cldn5 、Icam2 、Slc9a3r2）。使用Wilcoxon秩和检验和Bonferroni校正，通过最高差异表达来定义每个亚群的唯一标志物（图4A）。最大的种群（EC 1）是由许多典型的EC标志物（Vcam1）和高表达在EC中具有已知功能的其他基因（例如Clu、Gkn3和Eln）。第二个EC群体（EC 2）表达参与脂质转运的基因（Cd36，Fabp4，Lpl和Gpihbp1）和血管生成标志物（Flt1）。EC 3群体表达淋巴管内皮细胞的标志物Lyve1。
图3.内皮细胞（EC）分为3个不同的种群。
A，t-随机邻近嵌入（t-SNE）分析EC亚群。与所有其他主动脉细胞相比，这3个EC亚群具有独特的转录谱。
B，小鼠主动脉中所有VE-钙黏着蛋白阳性细胞的t-SNE图。重新标识了3个亚群以及少量（5％）的细胞群体，这些群体是基于液滴的单细胞RNA测序的伪像。
C，多个基因显示EC特异性表达，并在所有3个EC亚群中表达。 与所有其他细胞相比，在所有EC簇中表达的遗传标志物分为血管生成EC标志物基因和粘附/转运EC标志物基因。小提琴图的y轴显示了标准化的转录表达值。
每个亚群的特征是独特的转录因子谱（图4B）。为了表征这些基于转录因子的信号网络对亚群身份的贡献，使用TRRUST数据库鉴定了每个转录因子激活的已知靶标。EC2显示Pparg激活基因的表达明显更高（图4C），与该亚群中Pparg和其他脂质处理基因的更高表达一致。EC亚群中多种转录因子及其靶标的差异表达表明其不同的功能特性。
图4.内皮细胞（EC）亚群的基因表达特征。
A，每个EC亚群具有特异性表达的前20个基因。点图显示了表达每个基因的细胞百分比（点大小）和表达水平（点颜色）。
B，EC亚群的转录因子的差异表达。
C，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-G）在EC 1和EC 2亚群中的表达。*** Mann–Whitney U检验P <0.001。
为了系统地识别EC亚群的细胞功能，对细胞亚群的基因集富集表达谱进行分析。利用注释为与EC相关的生物学过程基因集对其进行区分，虽然可以明确将所有内皮细胞亚群与其他主动脉细胞区分开，但不足以解决亚群之间的差异（图5A）。进一步在每个亚群的前50个标志物进行了途径富集。EC1标志物选择性富集在细胞外基质组织和整联蛋白细胞表面相互作用途径，而EC2标志物选择性富集在血浆脂蛋白组装、重塑和清除途径，2个EC亚群之间存在显着差异（图5B）。
同时利用血管生成基因集区分2个亚群，EC中血管生成的异质性通常归结为“尖端”细胞与“茎”细胞之间的区别，研究发现利用尖端细胞基因可以有效的区分EC，并在EC 2中表达水平增加。
4 西方饮食喂养小鼠的主动脉中的scRNA测序揭示了内皮亚群的保守和饮食依赖性标志物
为了确定饮食对内皮细胞亚群标志物的影响，本研究分析了饲喂正常和西方饮食的小鼠的主动脉scRNA测序谱。基于PAC显示了数据集之间的差异（图6A），基于典型关联分析突显了两个数据集之间的相似性（图6B）。应用于相似性对齐的数据集的聚类算法显示了在正常主动脉数据中所确定的3个主要的亚群（图6C）。同样的所有EC亚群均表达EC特异性标志物，在两种饮食条件下都将它们与其他主动脉细胞类型区分开。进一步确定了所有EC亚群对西方饮食反应的标志物（图6D），包括肌球蛋白轻链9（Myl9）、转胶蛋白（Tagln）和Acta2在内的收缩功能的基因表达均上调。
图6 内皮细胞（EC）亚群的保守标志物和饮食依赖性标志物。
A，基于主成分分析的t-SNE分析正常饮食和西方饮食EC单细胞RNA测序谱。
B，基于典型关联分析的t-SNE分析正常饮食和西方饮食EC单细胞RNA测序谱。
C，在两个数据集中确定的EC的保守亚群。D，EC亚群的保守饮食独立标志物和饮食诱导的变化的泛亚群标志物。与饮食无关的亚群标志物与先前确定的标志物相同，而西方饮食在所有EC亚群中均诱导了收缩蛋白Myl9、Tagln和Acta2。
5 用亚群衍生标志物鉴定EC原位异质性
选择具有代表性的EC 1和EC 2标志物物以原位鉴定EC亚群的空间位置。根据scRNA测序数据，Vcam1和Cd36分别是EC1和EC2的标志物（图7A）。通过流式细胞术原位成像证实了Vcam1+/Cd36−和Vcam1−/Cd36+的EC群体（图7B）。主动脉根部和胸降主动脉的免疫荧光显示了Vcam1和Cd36表达的不同区域。在3个主动脉根部的样本中，在较小曲率下Vcam1/Cd36的对数平均值显着高于较大曲率（图7C）。主动脉根部较大曲率的ECs表现出低Vcam1表达和高Cd36表达，并具有细长形态；主动脉根部曲率较小的EC表现为长方体形态，同时具有较高的Vcam1表达和较低的Cd36表达（图7D、7E）。胸降主动脉的近端部分还具有高Vcam1和低Cd36的区域（图7F和7G）。
图7 鉴定出的内皮细胞（EC）亚群的组织学相关性。
A，Vcam1（EC 1相关标志物）和Cd36（EC 2相关标志物）的小提琴图比较。
B，具有Vcam1+/Cd36-和Vcam1-Cd36+的小鼠主动脉内皮细胞的流式细胞术，显示出对应于亚群标志物的异质性。数字表示每个象限中的细胞比例。
C，在大（GC）和小（LC）曲率的主动脉根的Vcam1 / Cd36比率的对数值。*** Mann–Whitney U检验P <0.001。
D，主动脉根中Vcam1和Cd36的免疫荧光显微图像。
E，主动脉根中Vcam1荧光强度和Cd36荧光强度。
F，降主动脉中Vcam1和Cd36的免疫荧光显微图像。
G，降主动脉中Vcam1荧光强度和Cd36荧光强度。
6 孟德尔主动脉病变基因的表达鉴定相关细胞和生物学途径
本研究应用该主动脉单细胞基因表达数据来确定不同细胞类型在主动脉疾病发病机理中的作用。通过确定具有与疾病相关的已知编码突变的30个基因的细胞特异性表达发现，其中多个基因在VSMC中表达量最高（图8A）。影响肌肉收缩的基因（例如Myhlk、Myh11）主要在VSMC中表达。具有细胞外基质功能的基因在成纤维细胞中表达量最高（例如Col5a2、Col5a1、Col3a1）。在VSMC、成纤维细胞和EC中，胸主动脉瘤和解剖引起的突变会分为不同的细胞表达模式（图8B）VSMC特异性基因：Myhlk、Myh11、Acta2和Flna；VSMC-成纤维细胞高但EC表达最少的细胞外基质相关的基因：Col4a5、Col5a1、Col5a2、Fbn1、Mfap5和Col3a1；只在EC中表达的Notch1。包括转化生长因子-β途径基因（Tgfb2S、mad2、Smad3、Smad4、Tgfbr1）和2个细胞外基质相关基因（Lox、Ern）在三种细胞中均表达。
图8.不同细胞类型的主动脉病变基因的表达。
A，按细胞类型表达与孟德尔主动脉病变相关的30个基因。大多数在血管平滑肌细胞（VSMC）中具有最高的表达，一些在成纤维细胞（Fibro）中显示最高表达。两个基因（Mat2a和Notch1）在内皮细胞（EC）中表达最高。
B，三元图显示了主动脉病变基因在EC、VSMC和成纤维细胞中的表达。几个基因仅在VSMC中表达，而大多数基因则主要在VSMC和成纤维细胞中表达。具有收缩功能的基因呈绿色；转化生长因子-β反应基因为红色；细胞外基质相关基因为蓝色；未分配的基因为黑色。Macro表示巨噬细胞；Mono表示单核细胞。
结论
本研究比较了两种不同的酶解单细胞方案和序列深度，发现胶原酶和弹性蛋白酶的结果相似。但是，某些方法可能更适合于特定的细胞类型，例如弹性蛋白酶可以提高VSMC产量。而高深度和低深度测序的配置文件的比较表明可以相对较浅的测序识别血管组织中的细胞群。
本研究在主动脉中鉴定了3个不同的EC亚群，EC异质性在血管功能中发挥重要的作用，主动脉中的scRNA测序可以识别在EC中动态调节的全套转录谱。3个EC亚群共享一些标志物，但多个基因的表达不同，表明EC亚群在细胞外基质产生、脂质处理和血管生成或淋巴功能方面的功能具有区别。2个主要EC种群的空间分布进一步证明，转录异质性可以识别功能不同的细胞亚群。在较小和较大的主动脉曲率中观察到EC 1（Vcam1）和EC 2（Cd36）的独特分布模式，可能是血流和切应力不同的结果。但不能确定这些亚群是仅由于环境暴露（例如剪切应力）还是发育的结果，需要进一步研究。此外，本研究对EC亚群如何应对病理应激源进行分析，发现暴露于西方饮食后EC的收缩基因表达上调。
最后本研究提出使用scRNA测序分析完整的血管环境可以为疾病发病机理提供重要见解。研究划分了3种主要血管壁细胞类型对孟德尔主动脉病变的相对贡献，为进一步了解遗传性主动脉瘤的基因型与表型的相关性提供基础，并为这些疾病开发针对性的疗法提供指导方向。
事实证明，基于液滴的scRNA测序的转录谱分析是定义细胞身份的标准。在人类细胞图谱协会的努力下，单细胞转录组学的方法正在迅速发展，为深入研究包括血管细胞等各种生物学试验提供支持。
评论
广泛存在于人体所有器官中的血管和动脉壁细胞易患多种疾病，对其单细胞异质性的了解较少，scRNA技术使无偏向性的表征复杂的动脉组织中的各种细胞成为可能。本研究使用最新的基于液滴的scRNA测序方法来表征来自整个鼠主动脉的6200个细胞中表达的基因和功能途径，鉴定出形成该大动脉主要细胞类型的10个细胞簇：成纤维细胞、VSMC、EC和免疫细胞群。还确定了小鼠主动脉内具有不同功能的EC的3个不同亚群。同时孟德尔主动脉病变综合征相关的基因在不同亚群中的分布可以说明这些细胞类型特异性转录谱的临床应用价值。本研究证明利用scRNA测序技术可以表征基因表达的异质性，进一步用于区分主要的细胞类型及具有不同功能的亚群，为深入研究各种血管疾病的发生机制提供了重要的方法借鉴。
更多推荐
1 综述 | 英国爱丁堡大学医学院皇后医学研究所Neil CHenderson等：使用单细胞转录组学揭示纤维化