科研 | Nature：Fat1缺失促进混合EMT状态、肿瘤干性和转移
编译：谢婉秋，编辑：Tracy、江舜尧。
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近日，来自比利时布鲁塞尔自由大学干细胞与癌症实验室的Cédric Blanpain课题组在Nature杂志上发表了一篇题为《Fat1 deletion promotes hybrid EMT state, tumourstemness and metastasis》的文章，在这项研究中，作者使用小鼠皮肤鳞状细胞癌和肺癌模型，发现Fat1的缺失可以加速肿瘤的发生和恶性进展，并促进了上皮细胞向间充质细胞转化（epithelial-to-mesenchymaltransition, EMT）的混合表型，同时也在FAT1突变的人鳞状细胞癌中发现这种EMT状态，此外，作者发现Fat1缺失的皮肤鳞状细胞癌表现为肿瘤干性增加和自发转移。就机制而言，作者证实了FAT1功能的丧失激活了促进YAP1核转位的CAMK2–CD44–SRC轴，以及刺激间质状态的ZEB1表达，这种丧失也能使EZH2失活，促进负责维持上皮状态的SOX2表达。总而言之，这项工作确定了FAT1缺陷型肿瘤的耐药性和脆弱性，在小鼠和人类鳞状细胞癌中，FAT1的功能丧失通过诱导混合EMT状态促进肿瘤的发生、发展、侵袭性和转移，这一发现对肿瘤研究具有重要意义。
论文ID
实验设计
实验结果
1.Fat1缺失促进恶性进展
为了评估Fat1 LOF是否促进肿瘤的发生，我们使用Krt14-cre(Krt14-cre；Fat1flox/flox；Rosa26YFP/+；以下简称Fat1-结构性敲除(Fat1-CKO))小鼠模型，在皮肤表皮进行了条件性Fat1缺失。Fat1-CKO小鼠按孟德尔比例出生，没有出现皮肤异常(扩展数据图1)。在给予DMBA/TPA后，肿瘤发生发展得更快：在Fat1-CKO小鼠中，每只小鼠的良恶性肿瘤数量增加，这表明Fat1在DMBA/TPA诱导的皮肤SCCs中起着肿瘤抑制基因的作用(扩展数据图2a-f)。为了评估FAT1在调节恶性进展中的作用，我们使用诱导性Krt14-Creer(Krt14-Creer；Fat1flox/flox；Rosa26YFP/+)对良性乳头状瘤进行了Fat1的急性缺失。免疫组织化学染色和电镜分析显示，在Fat1缺失后，基底细胞的极性以及粘附物和紧密连接迅速丧失，基底层中断以及半桥粒减少，同时良性肿瘤分化特征的KRT10表达迅速消失，表明Fat1缺失促进了恶性肿瘤进展的潜在机制。
这些数据表明，Fat1的缺失通过控制细胞极性和肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与细胞外基质之间的粘附促进恶性进展。
2.FAT1缺失促进了一种混合性EMT
我们在良性乳头状瘤中观察到的组织学差异在恶性SCC中同样存在。Fat1-CKO肿瘤细胞凝聚力较差，形状呈圆形；大多数肿瘤细胞表达间充质标志物波形蛋白。流式细胞仪分析显示，Fat1-CKO SCCs中含有大量的EPCAM−细胞，这在DMBA/TPA诱导的含有野生型Fat1的SCCs中是非常罕见的。EMT发生在肿瘤进展的早期，因为我们在乳头状瘤中可以检测到EpCAM−肿瘤细胞(图1a-c)。
以不同水平的细胞表面标记物EPCAM、CD106、CD61和CD51的表达为特征，代表EMT过程中的不同阶段。大多数Fat1-CKO EpCAM− EMT细胞CD106、CD61和CD51标记为阴性或单独表达CD106，这代表了两个EMT亚群，其特征是在遗传诱导的皮肤SCC中上皮和间质标记共同表达。我们对FACS分离的肿瘤细胞进行了细胞旋蛋白检测，证实Fat1缺失促进了共表达上皮(KRT14)和间充质(波形蛋白)标记的混合EMT亚群的出现(图1c-f)。这些数据表明，肿瘤抑制基因的基因突变可以促进混合EMT表型的获得。
为了评估Fat1 LOF在其他模型中是否促进混合EMT表型，我们将Fat1和p53(也称为Trp53)的缺失与KrasG12D在不同表皮谱系中的表达结合起来。以毛囊间表皮为靶点的Krt14-Creer可诱导分化良好、无EMT特征的SCC，而以毛囊为靶点的Lgr5-Creer可诱导不同程度EMT的异质肿瘤。与我们在DMBA/TPA来源的干细胞中发现的相似，在Krt14-creER；KrasG12D；p53cKO；Fat1cKO；Rosa26YFP/+小鼠模型中Fat1的丢失促进了混合EMT表型的获得，而Lgr5-creER-诱导的SCCs，其不依赖于Fat1缺失而表现出高比例的EMT表型，并没有进一步增加Fat1 LOF下的EMT表型。与对照组相比，大多数Lgr5-Creer Fat1-CKO肿瘤细胞表达KRT14，并呈现鳞状分化的迹象。这些数据表明，在三种独立的皮肤鳞状细胞癌小鼠模型中，Fat1缺失促进了稳定的混合EMT表型获得。
为了评估Fat1缺失对肿瘤杂交状态的促进作用是否是皮肤特异性的，我们通过气管内灌注表达cre的腺病毒，将Fat1和p53缺失与KrasG12D在肺上皮细胞中的表达结合起来。FAT1缺失显著增加了肺肿瘤的数量(扩展数据图4n,o)，这些肿瘤也显示出混合EMT的迹象。KrasG12D的表达和p53的缺失促进了以NKX2-1(也称为TTF1)表达为特征的腺癌的发生，而Fat1的同时缺失促进了肺SCC的形成，其特征是NKX2-1的表达减少以及SOX2的表达(图1g-l)，这与在肺鳞状细胞癌中发现的FAT1突变的比例高于其他类型的肺癌是一致的，暗示FAT1突变可能是鳞癌表型的驱动力。
为了评估我们的发现与人类的相关性，我们使用CRISPR-Cas9对A388人上皮SCC细胞系中进行了FAT1缺失。FAT1缺失后，细胞粘连减少，细胞变圆，E-cadherin表达减少，上皮细胞(KRT14，p63和SOX2)和间质(vientin和ZEB1)标记共表达(图1M)，这与在小鼠SCC中发现的混合EMT状态相一致。通过对来自患者不同器官来源的异种移植的鳞状细胞肉瘤进行测序，我们鉴定了存在和不存在FAT1 LOF突变的SCC。角蛋白和波形蛋白的联合免疫染色显示，与野生型FAT1的SCC相比，FAT1突变的SCC表现出更高的混合EMT分数(图1n,o)，这些数据表明，在人类癌症中，FAT1突变促进了混合EMT状态的获得。
3.FAT1缺失促进干性和转移
FAT1缺失可以促进肿瘤的干性，转移的EMT以前被认为与肿瘤干性的增加有关。对Fat1-CKO和野生型EPCAM+和EPCAM−肿瘤细胞的肿瘤移植试验表明，与Fat1野生型相比，Fat1LOF与肿瘤增殖细胞的数量增加了10倍(图2a-b)。肿瘤的干性也与体外克隆形成能力的增强有关，为了验证我们的发现，我们在3D肿瘤球体实验中评估了野生型和FAT1基因敲除的人SCC细胞系的克隆形成能力，FAT1基因敲除细胞系比同基因野生型对照细胞系生长得更快(图2c-d)。总之，这些数据表明，在小鼠和人类癌症中，FAT1缺失促进了肿瘤的干性。
混合性EMT肿瘤状态与循环肿瘤细胞的存在，和静脉注射肿瘤细胞时转移潜能的增加有关。值得注意的是，在Fat1-CKO小鼠中，出现淋巴结和肺转移的小鼠的比例和每只小鼠的转移数量都增加了(图2e-h)。静脉注射EpCAM+Fat1-CKO肿瘤细胞比带有野生型Fat1的肿瘤细胞有更多的肺转移(图2I-l)，这表明Fat1LOF大大增加了皮肤SCC的自发转移和肺定植，这与原发肿瘤的数量或EMT的发生无关。这些数据表明，Fat1-LOF诱导的混合EMT状态促进了体内的转移。
4.Fat1突变肿瘤的基因特征
为了研究Fat1 LOF促进混合EMT状态的分子机制，我们首先研究了来自小鼠皮肤SCC的Fat1突变肿瘤细胞的转录特征。RNA序列分析显示，Fat1-CKOEPCAM+肿瘤细胞出现了EMT标志物的大幅度上调，比如VIM、SnAI1、Prrx1、Twist1、ZEB1或ZEB2，这些基因在EPCAM− Fat1-敲除肿瘤细胞中的表达进一步上调。与来自Lgr5-Creer、KrasG12D、p53cKO来源的完整上皮细胞的EPCAM−肿瘤细胞相比，EPCAM−Fat1-Cko肿瘤细胞继续高水平表达几种上皮基因(如Krt14、p63和Sox2)。RNA-seq结果显示，Fat1-cKO肿瘤细胞的转录特征与来自Lgr5-Creer、KrasG12D、p53cKO SCC的CD106−CD61−CD51混合EMT肿瘤细胞EMT特征显著重叠，而与完全EMT特征没有显著重叠(图3a-b)。
来自EpCAM+和EpCAM−Fat1-Cko肺癌细胞以及CRISPR-Cas9FAT1敲除的人鳞状细胞癌细胞的RNA-seq数据表明，在这两种情况下，相似的间质基因(包括ZEB1、ZEB2和VIM)在FAT1缺失后上调，揭示了与不同肿瘤类型以及小鼠和人类癌症之间的FAT1缺失相关的共同基因特征。重要的是，我们发现，这种常见的FAT1突变信号的高表达与肺鳞状细胞癌患者的低存活率有关(图3c-e)。
5.YAP1和SOX2调节杂交EMT
为了确定FAT1缺失后导致混合EMT状态的染色质变化，我们对FACS分离的野生型和Fat1-CKO EpCAM+和EpCAM−肿瘤细胞进行了转座酶染色质测序(ATAC-SEQ)。我们在关键的EMT转录因子(如ZEB1、Snail1或Twist2)和其他EMT标记(如Vim或COL6A3)中发现了增强子，与EpCAM+野生型细胞相比，在EpCAM+Fat1-CKO肿瘤细胞中更容易获得增强子，这可能解释了肿瘤细胞在Fat1缺失时进行EMT的表观遗传启动。通过在野生型和Fat1突变的肿瘤细胞之间可区分的染色质区域进行基序发现，我们发现AP1(也称为Jun)和Tead转录因子基序在Fat1突变的肿瘤细胞的染色质区域中高度富集，这些染色质区域也增加了YAP1的表达(图3f)，这表明Jun和FOS转录因子家族与其他转录因子包括te1的转录因子合作。
为了确定在EpCAM−Fat1-Cko肿瘤细胞中调控上皮基因持续表达的转录因子，我们在epCAM−Fat1-cKO中上调的atac-seq峰中进行了分析。我们发现AP1、SOX或KLF基序在EPCAMEMTFAT1-−细胞中高度富集(图3g)，这表明Fat1-CKO上皮细胞的混合EMT状态是由AP1-SOX2-KLF轴调控的。SOX2在许多人的SCC中扩增，并标记皮肤SCCs中的肿瘤干细胞，可能与Fat1-CKO肿瘤细胞中上皮基因的持续表达有关。
为了从功能上验证生物信息学预测，我们评估了CRISPR-Cas9介导的YAP1和Taz或Sox2基因缺失对小鼠皮肤SCC的肿瘤干性、转移和基因表达程序的影响。在来源于Lgr5-Creer、KrasG12D、p53cKO、FatcKO SCC的原代EpCAM−细胞系中，SOX2、YAP1和TAZ的缺失都降低了肿瘤增殖细胞的频率和转移数量(图3h-i)，这表明SOX2、 YAP1和TAZ对于促进Fat1缺失后的肿瘤干性和转移是重要的。在3D球体实验中，人SCC细胞系中的SOX2或YAP1缺失降低了FAT1缺失介导的肿瘤生长程度(图3j)，这表明SOX2和YAP1在人癌细胞中促进了FAT1缺失下游的肿瘤生长，而同一细胞系中E-cadherin基因(Cdh1)的缺失导致细胞黏附缺陷不会诱导SOX2或ZEB1的表达，也不会增加核YAP1的表达。在FAT1基因敲除细胞中过表达Cdh1并没有降低FAT1缺失诱导的间充质基因的克隆形成或表达，这表明FAT1缺失对肿瘤干性的促进或混合EMT表型不仅仅是细胞粘附缺陷的结果。
在Lgr5-Creer、KrasG12D、p53cKO、FatcKO SCC中SOX2的缺失导致皮下移植时上皮特性的丧失和从混合到完全EMT的转变，而YAP1和Taz的缺失促进了早期的混合EMT状态(如免疫染色和FACS分析所示)(图3k-m)。来自FAT1和SOX2基因敲除的RNA-seq数据进一步证明了晚期EMT信号的显著丰富，标志是间充质标志物(例如lox和pGFRA)的增加和上皮标志物的减少(例如cebpa、krt5和p63)，而 Fat1、YAP1和Taz三重敲除SCC的转录组显示EPCAM+上皮和早期混合EMT信号显著丰富。与Fat1相比，Fat1、YAP1和Taz三重敲除后，YAP1和TAZ的许多经典靶基因(例如CTGF(也称为Ccn2)、Amotl2和FSTL1)以及EMT基因(例如Vcam1、Thy1和PDGFRb)都减少了(图3n,o)。总之，这些数据表明，SOX2、YAP1和TAZ控制着不同的转录程序，导致Fat1 LOF下游稳定的混合EMT表型。
6.FAT1下游的信令级联
为了了解FAT1 LOF如何激活SOX2或YAP1和TAZ，我们对野生型和CRISPR-Cas9 FAT1基因敲除的人SCC细胞进行了磷酸化蛋白质组学分析。与FAT1野生型相比，我们鉴定出在FAT1基因敲除肿瘤细胞中有288个亚磷酸盐显着上调，335个显着下调。FAT1 LOF诱导细胞间粘附相关蛋白(如ZO1或ZO2)的磷酸化水平降低，以及PRKCD、EGFR、ERBB2、MEK1、MEK2、AKT2或MTOR的磷酸化水平降低。与磷酸化蛋白质组学分析相一致的是，在FAT1基因敲除的肿瘤细胞中，MEK1和MEK2的磷酸化程度显著降低，EGFR和磷酸化的EGFR的总水平降低(图4a-c)。这些数据表明，在FAT1 LOF时，EGFR-RAS-RAF-MEK-MAPK和EGFR-PI3K-AKT-MTOR信号通路减少。
相反，FAT1缺陷的肿瘤细胞表现为SRC家族的YES酪氨酸激酶以及MAP1B和GJA1蛋白的磷酸化显著增加。GJA1磷酸化促进GJA1在质膜上的定位，并增加功能缝隙连接的形成，这与转移能力的增加有关。这些数据表明，FAT1 LOF诱导了细胞间粘附、细胞通讯和细胞骨架的重塑，并且与混合EMT状态的获得有关。
为了破译FAT1 LOF下游的信号级联，我们使用PhosphoSitePlus在线工具预测我们确定的亚磷酸盐上游的激酶。钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMK2)是我们发现最常作用于FAT1基因敲除肿瘤细胞中的磷酸肽上游的激酶(S70619上的CD44和S328、S325、S306、S330、S364和S36520上的GJA1)。与生物信息学预测一致，Western blot分析表明，与FAT1相比，CaMK2在FAT1 LOF中的磷酸化程度要高得多，我们进一步证实SRC和YES在FAT1LOF上也表现出高水平的表达和磷酸化。SRC和YES的免疫沉淀表明，FAT1基因敲除后，YES的表达和磷酸化程度大大增加；FAT1野生型和非基因敲除肿瘤细胞之间的SRC水平相当，而FAT1基因敲除后SRC磷酸化水平增加。用CaMK2抑制剂(KN93)处理能够大大降低SRC和YES的磷酸化水平，表明CaMK2直接或间接地在FAT1LOF上磷酸化YES和SRC(图4d-f)。
CD44在EMT过程中上调，促进肿瘤的干化、进展和转移。先前的计算分析预测，ESRP1-CD44-ZEB1轴可以稳定人肺癌细胞中的混合EMT状态。CD44被不同的激酶磷酸化(包括CAMK223)，调节其在细胞内的定位和活性。为了评估CD44在S706的磷酸化(在FAT1LOF的基础上上调)是否会影响CD44的细胞定位，我们进行了FACS分析，发现在FAT1基因敲除的细胞中，细胞表面CD44的水平增加，而用CaMK2抑制剂处理后，CD44的水平显著降低(图4g-I)。为了确定CaMK2是直接磷酸化FAT1基因敲除细胞中的YES和SRC，还是通过CD44信号途径磷酸化SRC，我们在FAT1基因敲除细胞中用CRISPR-Cas9敲除了CD44，发现CD44和FAT1双基因敲除后SRC的磷酸化水平降低(图4g-j)。这些数据表明，在FAT1 LOF上，CaMK2至少部分通过CD44激活SRC。在3D肿瘤球体分析中，FAT1和CD44双敲除的人SCC细胞的克隆性显著降低(图4k)，这表明CD44的稳定有助于在FAT1 LOF观察到的肿瘤干性增加。
我们进一步评估了CaMK2-CD44-SRC信号是否能促进混合EMT表型。我们发现，经CaMK2(KN93)或SRC(沙拉卡替尼或达沙替尼)抑制剂处理的FAT1和CD44双基因敲除细胞和FAT1基因敲除细胞，细胞核YAP1和ZEB1显著减少，E-cadherin表达增加，并在更紧密的上皮集落中生长。这些结果表明，FAT1 LOF激活了CaMK2-CD44-SRC-YAP-ZEB1轴，促进了间充质表达。我们观察到只有在用CaMK2抑制剂处理的FAT1基因敲除肿瘤细胞中SOX2的表达减少；然而，在抑制CD44-SRC通路时，SOX2的表达没有变化(图4l)。
磷酸化蛋白质组学分析显示，在FAT1基因敲除细胞中，T487处EZH2的失活磷酸化增加，EZH2属于PRC2复合体，它在K27处甲基化H3，介导转录抑制。在SCCs的形成过程中，该组蛋白标记在SOX2位点重塑。我们推测，在FAT1基因敲除细胞中抑制EZH2可以减少K27(H3K27me3)抑制组蛋白标志处H3的三甲基化，从而促进SOX2的表达。在FAT1基因敲除细胞中，H3K27me3的整体水平显著降低，这表明EZH2在FAT1 LOF上的活性可能较低；给予CaMK2抑制剂增加了FAT1基因敲除细胞中H3K27me3的整体水平，这与CaMK2激活抑制肿瘤细胞中EZH2和PRC2活性的观点一致。为了进一步验证这一假设，我们用EZH2抑制剂(GSK343)处理FAT1野生型细胞，观察到处理7天后H3K27me3减少，SOX2 mRNA和蛋白表达增加，这进一步表明SOX2受FAT1-CaMK2-EZH2依赖的表观遗传学调控。染色质免疫沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)表明，FAT1缺失后SOX2启动子周围的H3K27me3标记显著减少，进一步证明了FAT1缺失通过表观遗传机制调控SOX2的表达(图4m-r)。
由于YAP1和TAZ信号可以由细胞外基质的硬度调节，我们评估了底物硬度对YAP1和SOX2表达的影响。与FAT1野生型细胞相比，即使在柔软的底物上，FAT1基因敲除的肿瘤细胞也表现出高水平的总YAP1和核YAP1表达，这表明FAT1缺失结构性地激活了导致YAP1高表达的信号通路；这导致FAT1基因敲除细胞的行为（就YAP1核表达而言）就像肿瘤细胞暴露在坚硬的底物中一样。没有观察到SOX2表达的变化，表明SOX2在FAT1LOF上被结构性激活，而不受细胞外基质硬度的影响。
7.FAT1突变肿瘤的药物脆弱性
为了测试在FAT1 LOF上改变的信号级联反应是否可以预测FAT1突变癌症的治疗耐药性和敏感性，我们评估了野生型和等基因FAT1基因敲除的人类癌细胞株对我们发现的野生型和FAT1基因敲除细胞之间存在差异调节的信号通路抑制剂的敏感性。EGFR抑制剂（如阿法替尼）和MEK抑制剂（如曲美替尼）被广泛应用于转移性SCC患者。与体外培养的FAT1野生型SCC细胞相比，FAT1基因敲除的细胞对阿法替尼和曲美替尼的抵抗力明显更强(图4s-u)。
相反，与FAT1野生型肿瘤细胞相比，FAT1基因敲除肿瘤细胞对SRC抑制剂达沙替尼和塞卡替尼以及CaMK2抑制剂KN93的敏感性要高得多(图4s-u)。我们对移植有FAT1野生型和基因敲除型人SCC细胞系的小鼠给予阿法替尼和达沙替尼，发现FAT1野生型肿瘤细胞对阿法替尼更敏感，而FAT1基因敲除型肿瘤细胞对达沙替尼更敏感(图4v-w)，这与体外观察到的药物敏感性差异是一致的。
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