编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读
原发性膜性肾病（pMN）是成人肾病综合征的主要病因。在大多数情况下，这种自身免疫性肾病与肾足细胞上表达的抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R1）的自身抗体有关，但导致肾小球损害的机制仍不清楚。在本篇文章中，我们利用人足细胞建立了一个细胞培养模型，发现抗PLA2R1阳性的pMN患者血清或分离的IgG4，在补体存在的情况下诱导两种必需的足细胞蛋白突触拓扑素和肾素1的蛋白水解，导致足细胞细胞骨架的不稳定。特异性阻断凝集素通路可阻止synaptopodin和NEPH1的降解。抗PLA2R1-IgG4以糖基化依赖的方式直接结合甘露糖结合凝集素。在一组pMN患者中，我们发现半乳糖缺乏的IgG4水平升高，与患者血清诱导的抗PLA2R1滴度和足细胞损伤相关。末端C5b-9补体复合物的组装和补体受体C3aR1或C5aR1的激活需要通过两种不同的蛋白水解途径（分别由半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶介导）诱导synaptopodin和NEPH1的蛋白水解。总之，这些结果证明了在原发性膜性肾病中，异常糖基化IgG4激活凝集素通路并诱导足细胞损伤的机制。原名：Altered glycosylation of IgG4 promotes lectin complement pathway activation in anti-PLA2R1 associated membranous nephropathy译名：抗PLA2R1相关膜性肾病中IgG4糖基化改变促进凝集素补体通路激活期刊：Journal of Clinical Investigation
1. 利用western blot检测四种不同条件永生化人足细胞系中PLA2R1、synaptopodin和NEPH-1蛋白的表达水平；
2. 在加入患者血清和NHS后检测潜在的亚溶解足细胞损伤，分析与足细胞损伤有关的四种必需足细胞蛋白；
3. 在大量pMN和对照组患者中检验synaptopodin和NEPH1的作用；
4. 免疫荧光分析抗PLA2R1-IgG4激活凝集素通路是否是糖基化依赖的；
5. 通过ELISA检测MBL与抗PLA2R1-IgG4的直接结合；
6. 从4名患者的血清中分离出抗PLA2R1特异性IgG4，并分析其糖基化模式；
7. 测试过敏毒素C3a和C5a是否也参与抗PLA2R1介导的足细胞损伤。
1. 抗PLA2R1阳性血清诱导人足细胞synaptopodin和NEPH1的快速丢失在体内，PLA2R1在人肾小球足细胞表面内源性表达；然而，我们没有在四种不同条件永生化人足细胞系中检测到PLA2R1蛋白的相关水平，所有这些细胞系都表达足细胞标记物synaptopodin和NEPH-1（补充图1）。因此，我们利用慢病毒基因转移在分化培养的足细胞中表达PLA2R1，使其在体内的表达水平与正常人肾小球中的表达水平相当（补充图2A-C）。在诱导细胞分化的条件下，所有后续实验所用的足细胞系表达关键的足细胞蛋白synaptopodin、NEPH1、podocalyxin和podocin（补充图1E）。PLA2R1的慢病毒表达不诱导细胞的形态改变，也不改变synaptopodin和NEPH1的表达水平或其亚细胞分布（补充图2D）。在培养的啮齿动物足细胞中，我们加入抗足细胞抗体和低温保存的血清作为补体的来源，这已经被证明在高浓度下诱导细胞溶解，而低浓度的抗体和补体诱导亚细胞性足细胞损伤。相反，用抗PLA2R1阳性患者血清和高浓度低温保存的正常人血清（NHS）作为功能性补体系统的来源来治疗表达PLA2R1的人足细胞，尽管PLA2R1依赖的补体成分沉积，但并没有诱导细胞裂解（补充图3）。尽管没有溶解作用，但我们在加入患者血清和NHS后检测了潜在的亚溶解足细胞损伤，其浓度与啮齿动物足细胞实验中的浓度相似。我们分析了与足细胞损伤有关的四种必需足细胞蛋白（两条横膈膜相关蛋白、一种肌动蛋白相关蛋白和一种细胞表面蛋白）的水平，以及先前与啮齿动物细胞亚溶解补体损伤相关的两种途径ERK和Akt途径。虽然podocin和podocalyxin蛋白水平保持不变，但我们通过western blot分析观察到synaptopodin和NEPH1水平迅速降低（图1A）。免疫荧光显示synaptopodin和NEPH1减少并重新分布，肌动蛋白应力纤维减少，细胞变圆程度不同（图1B和补充图4）。Synaptopodin和NEPH1的缺失依赖于PLA2R1的表达，仅发生于高滴度的抗PLA2R1阳性MN血清中，需要活跃的补体系统，且与所使用的细胞系无关（补充图5-7），而针对小鼠足细胞裂解物的绵羊抗血清对培养的小鼠足细胞中的synaptopodin和NEPH1没有影响，而人类抗PLA2R1阳性MN血清对表达PLA2R1的小鼠足细胞中的synaptopodin和NEPH1水平有很强的影响（补充图8）。鉴于对podocin蛋白水平没有影响，我们还分析了podocin和nephrin的转录，两者均未受影响（补充图9）。饥饿后血清诱导ERK和Akt磷酸化，但这种作用不依赖于患者血清的PLA2R1阳性率、PLA2R1表达或活性补体系统，而是倾向于在用高滴度血清和补体处理的PLA2R1表达细胞中减少（补充图6）。接下来，我们在大量pMN和对照组患者中验证了synaptopodin和NEPH1的作用，并观察到其对PLA2R1相关pMN具有特异性（图1C），并与ELISA测定的抗体水平相关（图1D）。我们还检测到抗FSGS患者血清中synaptopodin和NEPH1的降解，但这并不依赖于PLA2R1的表达（补充图10）。
图1 抗PLA2R1阳性血清诱导synaptopodin和NEPH1的补体依赖性降解（A）用含PLA2R1慢病毒感染的分化人足细胞和空载体感染的对照细胞与2.5%高抗体滴度（>1:160）的抗PLA2R1阳性患者血清预先孵育30分钟，用5%NHS作为补体源处理指定时间段，并用western blotting分析蛋白质表达。条形图代表5名患者中每名患者3个独立实验平均值的平均值±SEM，*P<0.05，通过单因素方差分析和Tukey的事后检验进行比较，t=0。（B）用抗PLA2R1抗体滴度为451 RU/mL的患者血清进行synaptopodin、NEPH1和肌动蛋白纤维的免疫荧光分析。使用Leica SP8直立共焦显微镜和63X物镜拍摄代表性图像。（C）这一结果在一大批抗PLA2R1阳性的pMN患者（pMN+）中得到证实，这些患者有活动性疾病或缓解期（act/rem）、抗PLA2R1阴性的pMN患者（pMN-）、继发性MN（sMN）、其他肾小球疾病（other）和健康对照组。所示为血清预孵育和NHS暴露60分钟后synaptopodin和NEPH1的水平。注意，一名患有FSGS的患者（另一组）显示synaptopodin和NEPH1减少，这并不依赖于PLA2R1的表达（补充图10）。（D）synaptopodin和NEPH1水平与检测中使用的患者血清抗PLA2R1抗体浓度的相关性。2. 抗PLA2R1 IgG4通过凝集素途径激活补体在含有钙和镁的明胶veronal缓冲液中，我们通过经典和凝集素途径激活补体所需的钙和镁，发现足细胞始终显示synaptopodin和NEPH1水平显著降低（图2A）。添加重组人甘露糖结合凝集素（MBL）导致synaptopodin和NEPH1水平进一步降低，添加重组人甘露糖结合凝集素(MBL)导致和NEPH1水平进一步下降，而使用Mg2+/EGTA缓冲液去除钙离子，可抑制经典凝集素途径，保护synaptopodin和NEPH1免受补体诱导的降解（图2A）。这些结果暗示了凝集素通路的相关作用。因此，我们使用SGMI-1和SGMI-2这两种MASP-1和-2的单特异性抑制剂来选择性阻断凝集素途径。SGMI-1或SGMI-2的加入有效地挽救了synaptopodin和NEPH1的降解，清楚地表明了凝集素途径的主要作用（图2B）。虽然pMN中的抗PLA2R1自身抗体主要是IgG4亚类（一般认为IgG4亚类不结合并激活补体），但其他IgG亚类也有较小程度的存在。为了确定IgG4对于观察到的足细胞效应是否必要和充分，我们使用三种高滴度抗PLA2R1阳性患者血清中纯化的IgG4进行补体分析（补充图11）。纯化的IgG4结合到非通透性的表达PLA2R1的足细胞表面，并显示出与PLA2R1的完美共定位（补充图12），证实了PLA2R1的细胞表面表达和纯化IgG4的PLA2R1反应性。纯化的IgG4诱导补体沉积以及synaptopodin和肾素1降解，而IgG4缺失的抗PLA2R1血清（在ELISA中失去了对PLA2R1的反应性）仅在足细胞上固定低水平的补体，并且不诱导synaptopodin和肾素1降解（图3A和B，补充图13）。
图2 synaptopodin和NEPH1的降解依赖于凝集素途径（A）表达PLA2R1的足细胞在不完全RPMI1640培养基（第二车道）或各种明胶veronal缓冲液（GVB）中用2.5%高滴度（1:1000，2138 ru/mL）抗PLA2R1阳性患者血清预培养30分钟后用5%NHS处理60分钟。EDTA（GVBE）通过消耗钙和镁抑制所有补体途径，在钙和镁存在下添加重组MBL进一步促进凝集素途径的激活，并且在镁存在下用EGTA（GVBMg）消耗钙抑制经典和凝集素途径，但是允许激活替代补体途径。S=血清，C=补体。（B）在SGMI1和SGMI2存在下进行相同的实验，SGMI1和SGMI2分别是激活凝集素途径MASP1和MASP2所需的两种蛋白酶的特异性抑制剂。条代表3个独立实验的平均值±SEM，*P<0.05通过单因素方差分析和Tukey的事后检验与对照组（A）或s+C（B）进行比较。3. 抗PLA2R1-IgG4对补体的激活依赖于糖基化免疫球蛋白通过N-糖基化进行翻译后修饰,而附着在人IgG的每个CH2结构域的保守天冬酰胺297上的N-连接聚糖是IgG效应器功能的重要调节剂。在类风湿性关节炎中，半乳糖缺乏的IgG糖型已被证明直接结合MBL，因此我们假设抗PLA2R1-IgG4激活凝集素通路可能依赖于糖基化。事实上，在去糖基化后，尽管对PLA2R1的免疫反应保持不变（补充图14），来自pMN患者的IgG4不再诱导补体介导的synaptopodin和NEPH1降解（图3C）。免疫荧光分析显示，抗PLA2R1阳性pMN患者血清和分离的IgG4均能诱导MBL、补体C4d和C5b-9的沉积，降低synaptopodin和NEPH1的水平，触发肌动蛋白重排；而去糖基化的IgG4或血清中的IgG4不能将MBL固定在细胞上，不影响synaptopodin和NEPH1的水平，也不干扰肌动蛋白应激纤维（尽管仍能检测到一些C4d和C5b-9的沉积）。SGMI-1和SGMI-2预期不会干扰MBL结合，但会减少下游补体在细胞上的沉积，并挽救synaptopodin、NEPH1和肌动蛋白应激纤维（图4）。
图3 中性粒细胞血清对synaptopodin和NEPH1的影响依赖于IgG4，并具有糖基化依赖性表达PLA2R1的人足细胞在用2.5%的高滴度抗PLA2R1抗体（451和2138 RU/mL）患者的全血清（用所示浓度（A）的同一患者的纯化IgG4）预孵育30分钟后，用5%NHS处理60分钟，使用同一患者的IgG4缺失血清（B）或去糖基化IgG4（C）。2.5%全血清中IgG4的浓度为30 μg/mL。条形图代表两名患者六（A）或四（B，C）个实验的平均扫描电镜，经Mann-Whitney U检验，LV-PLS2R1与空载体的比较P<0.05。
图4 不同实验条件下补体沉积、synaptopodin和NEPH1表达及肌动蛋白纤维的免疫荧光分析用2.5%的高滴度（451 ru/mL）抗PLA2R1阳性pMN血清（pMN血清）处理感染PLA2R1慢病毒（LV-PLA2R1）或空病毒（EV）的人足细胞，从同一患者分离的总IgG4（pMN IgG4），最终浓度为100 μg/mL（ELISA中抗体水平为1295 RU/mL，浓度为8mg/mL），从同一患者分离的IgG4缺失血清（IgG4 dep pMN ser），其对PLA2R1无残留反应（4 RU/mL；阳性时切断为20 RU/mL），如上文所述，来自同一患者的去糖基化IgG4（去糖基化pMN IgG4）或存在SGMI 1和SGMI 2的患者血清，两者的浓度均为20μM（SGMI 1+2）和/或5%NHS作为功能补体来源。然后将细胞固定，通透性和染色C4d（绿色），C5b-9（绿色），MBL（绿色），NEPH1（绿色），synaptopodin（绿色）和肌动蛋白（红色）。用leicasp8垂直共聚焦显微镜和63X物镜拍摄图像。我们首先通过ELISA检测MBL与抗PLA2R1-IgG4的直接结合。来自pMN患者的总IgG4结合MBL明显多于对照IgG4，并且MBL结合被甘露糖抑制（补充图15）。接下来，我们以健康受试者的总IgG4为对照，在还原和非还原条件下对4例pMN患者的亲和纯化PLA2R1特异性IgG4进行凝胶电泳，并用MBL进行远蛋白印迹分析。MBL与完整的抗PLA2R1-IgG4（非还原条件）及其重链（还原条件）特异性结合，但不与控制IgG4结合（图5A和B），而先前抗PLA2R1-IgG4的去糖基化部分消除了MBL结合（图5C）。为了确定MBL与抗PLA2R1 IgG4的结合是否支持体外通过凝集素途径激活补体，我们将来自4名pMN患者和4名健康对照者的亲和纯化的抗PLA2R1特异性IgG4自身抗体固定在ELISA平板上，并与NHS一起培养，作为MBL和MASPs的来源；加入纯化的人C4以提高分析的灵敏度，并用1M NaCl使经典途径失活，从而破坏IgG和C1q之间的相互作用；其中，C4活化通过C4b的沉积来测量。结果显示，抗PLA2R1特异性IgG4自身抗体产生的C4b明显多于正常IgG4（图5D）。
图5 抗PLA2R1阳性IgG4直接结合MBL并触发凝集素途径激活（A）如图所示，在非还原性和还原性条件下，通过SDS-PAGE对来自pMN患者的亲和纯化的抗PLA2R1特异性IgG4进行解析，并对人IgG或MBL进行印迹和染色，无论是否事先与重组MBL孵育。（B）用另外4名pMN患者的抗PLA2R1特异性IgG4和健康对照组的总IgG4证实MBL结合。（C）用抗PLA2R1特异性IgG4重复实验，无论是否事先去糖基化。去糖基化后MBLto-IgG染色的密度比降低了64%。（D）用抗PLA2R1特异性或对照IgG4包被ELISA平板，然后在10 mm钙或1 mm EDTA存在下添加NHS作为MBL和MASPs、人C4和抗C4b抗体的来源。C4沉积的计算方法是有钙与无钙时的光密度（OD）差除以IgG4的量。横条代表四名pMN患者和四名对照者样本中三次测量的平均扫描电镜，经Mann-Whithey U检验，*P<0.05。5. pMN患者的IgG4抗体表现出糖基化模式的改变人类IgG糖基化谱的改变已在一些自身免疫性疾病中被报道，并影响IgG的效应功能。因此，我们分析了从pMN患者和对照组分离的IgG4的糖基化模式。在初步分析中，来自具有高抗PLA2R1抗体滴度（免疫荧光法≥1:320）的四名pMN患者的IgG4显示半乳糖缺失的G0F亚型显著增加，半乳糖基亚型相应减少（图6A）。这些结果在一个较大的原发性或继发性MN患者队列、年龄和性别匹配的健康对照组以及其他肾小球疾病患者中得到证实。我们发现半乳糖缺乏的G0F和G0FN亚型的相对数量增加，同时G1F和G2F亚型减少，这在细胞补体分析结果阳性的pMN患者中更为明显（图6B）。接下来我们从4名患者的血清中分离出抗PLA2R1特异性IgG4，并分析其糖基化模式。与来自这些患者的总IgG4相比，在抗原特异性IgG4组分中观察到的糖基化改变更为明显（图6C）；然而，改变的糖基化模式似乎是一种场效应，对抗PLA2R1-IgG4和IgG4都没有特异性，因为pMN患者的总IgG1和IgG2表现出相似的变化（补充图25）。值得注意的是，在细胞补体分析中，IgG4糖基化模式与抗PLA2R1抗体水平以及这些血清诱导的synaptopodin和NEPH1降解程度相关（图6，D-F和补充图26），并且倾向于与蛋白尿相关（补充图27）。
图6 来自pMN患者的IgG4抗体表现出改变的糖基化模式（A）从pMN患者和对照组（各4例）血清中纯化IgG4糖基化模式的初步分析。方框显示中位数和四分位间距，晶须最小值和最大值，*P<0.05非配对t检验。（B）在一个扩展队列中使用糖肽纳米LC-MS分析IgG4糖基化模式。比较了在细胞补体分析（n=10）中PLA2R1阳性pMN活动性疾病患者（n=31，活动性疾病的定义见补充表2）以及阳性结果（即在三个独立实验中synaptopodin和NEPH1在统计学上显著降低>25%）的整个队列年龄和性别匹配的健康对照组（n=39）。该框显示了中位数和四分位间距、胡须最小值和最大值，*P<0.05，根据年龄和性别差异调整了残余混杂。（C）从5例pMN患者（抗PLA2R1水平为451143ru/mL）的混合IgG4组分中纯化PLA2R1特异性IgG4，并将糖基化模式与这些患者的总IgG4进行比较。（D）所有活动性中性粒细胞患者暴露于患者血清和补体后，无乳糖IgG4（G0F+G0FN/总IgG4）分数与抗PLA2R1抗体水平，（E）与synaptopodin和（F）与NEPH1水平的相关性。关于糖基侧链命名法的解释，参见补充图16。补体通过三种激活途径中的任何一种激活，最终触发由补体成分C5b-9组成的膜攻击复合物（MAC）的形成，并产生过敏毒素C3a和C5a，通过细胞表面受体发出信号。在培养的啮齿类足细胞中，非IgG4抗体针对与PLA2R1无关的靶抗原诱导的亚细胞性补体损伤是通过C5b- 9插入细胞膜和随后的钙内流介导的，从而导致多种信号通路的激活；同样，在我们的细胞模型中，当我们使用C6缺陷血清作为补体来源时，synaptopodin和NEPH1被拯救（图7A），证实MAC组装是诱导其分裂所必需的。接下来我们测试了过敏毒素C3a和C5a是否也参与了抗PLA2R1介导的足细胞损伤。培养的人足细胞表达补体受体CR4、C3aR1、C5aR1和C5L2，但不表达CR1、CR2和CR3（补充图28）。尽管这些受体的单个基因沉默不能保护足细胞（补充图28C和D），但C3aR1和C5aR1的联合基因沉默导致足细胞受到补体介导的亚溶解性损伤的实质性保护，小分子抑制剂对这些受体的抑制也是如此（图7B和C）。因此，C3aR1和/或C5aR1的激活以及C5b-9的插入是抗PLA2R1和补体介导的synaptopodin和NEPH1降解所必需的。有趣的是，将足细胞暴露于pMN血清和补体后，C5aR1在体外的表达增加（补充图29）。在体内，我们观察到PLA2R1阳性pMN患者的存档活检样本中C3aR1和C5aR1的表达增加（图8A和B以及补充图30）。高滴度抗PLA2R1阳性患者的表达增加更为明显，尽管这种相关性没有达到统计学意义（补充图31）。在相同的活检样本中，我们证实了体内pMN患者的synaptopodin和NEPH1减少，synaptopodin水平与PLA2R1滴度呈负相关（图8C）。
（A）以2.5%的高滴度（1:1000，2138 RU/mL）抗PLA2R1阳性MN血清，然后暴露于5%NHS（S+C）或C6缺陷人类血清（S+C*）中1小时。（B）在siRNA介导联合敲除C3aR1和C5aR1（siC3aR1+SiC5aR1+S+C）或对照siRNA（siC+S+C）后，对足细胞中的NHS进行相同的实验。（C）在有无小分子C3aR和C5aR拮抗剂（分别为SB290157和W54011）的情况下，对具有高滴度（451ru/mL）抗PLA2R1抗体的患者血清进行相同的实验。条代表平均扫描电镜，*P<0.05，通过单因素方差分析和Tukey事后检验与对照组进行比较。
图8 补体受体的表达及synaptopodin和NEPH1在人中性粒细胞活检中的丢失（A）正常人肾组织和抗PLA2R1相关中性粒细胞患者的代表性活检切片，synaptopodin、NEPH1、C3aR1和C5aR1染色。图像由leicasp8垂直共聚焦显微镜和63X物镜拍摄。（B）与对照肾组织相比，抗PLA2R1阳性pMN患者synaptopodin和NEPH1的表达水平显著降低，而C3aR1和C5aR1的表达增加（10例pMN患者的11个活检，见补充表2，每个患者有2-10个肾小球，而不同个体有14个对照肾小球）。横条代表平均SEM，*P<0.05，通过Mann-Whitney U检验。（C）肾小球synaptopodin和NEPH1染色与抗PLA2R1抗体水平进行比较。7. synaptopodin和NEPH1通过两种不同的蛋白水解途径降解鉴于synaptopodin和NEPH1水平的迅速降低，我们怀疑这是一种蛋白水解机制。在某些肾小球疾病中，组织蛋白酶L通过钙调神经磷酸酶依赖的去磷酸化作用降解synaptopodin。与组织蛋白酶L切割一致，synaptopodin被半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64和钙调神经磷酸酶抑制剂环孢霉素A从补体介导的降解中解救出来（图9A和B）。虽然这些化合物不能拯救NEPH1，胃蛋白酶抑制剂A（一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂）却能特异性地保护NEPH1不被降解（图9C）。因此，足细胞的抗PLA2R1抗体依赖性补体损伤通过组织蛋白酶L导致synaptopodin降解，通过天冬氨酸蛋白酶导致NEPH1降解。由于dynamin是足细胞组织蛋白酶L的另一个蛋白水解靶点，我们测定了dynamin在足细胞抗PLA2R1和补体介导的损伤中的水平。Dynamin降解程度与synaptopodin相似，用E64预处理细胞即可挽救（补充图32）。synaptopodin被蛋白激酶A磷酸化，C3aR1和C5aR1都是G蛋白偶联受体，可以抑制树突状细胞cAMP的生成。因此，我们测试了在我们的pMN细胞模型中cAMP水平是否受到影响，并观察到添加抗PLA2R1阳性pMN血清和补体后足细胞中cAMP水平降低，这是通过抑制C3aR1和C5aR1阻止的（图9D）。
图9 synaptopodin和NEPH1降解相关蛋白酶的测定（A）用2.5%高滴度（1:1000）抗PLA2R1阳性人MN血清预处理含PLA2R1慢病毒的分化足细胞30 min，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64（20 μM）或载体预处理60 min后，用5%NHS作为补体（S+C）处理60 min。（B）用环孢素A（CsA，1 μM）进行相同的实验。（C）用各种蛋白酶抑制剂进行相同的实验，包括胃蛋白酶抑制剂A（1 μM）、亮肽（1 mM）、AEBSF（0.25 mM）或1 X蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。（D）同样的实验在C3aR和C5aR抑制剂SB290157和W54011分别单独或联合预处理60分钟后进行，并测量cAMP水平。n=3对于所有实验，条代表平均SEM，*P<0.05，通过单因素方差分析和Tukey事后检验。在本研究中，我们分析了抗PLA2R1相关pMN足细胞损伤的分子机制。我们确定synaptopodin和NEPH1是补体诱导足细胞损伤的靶点，这两种足细胞蛋白是必需的。我们在pMN患者中发现IgG4糖基化模式改变，并通过凝集素途径促进补体激活。大量证据表明补体在中性粒细胞的发病机制中起着核心作用；然而，补体激活途径和相关的补体效应机制仍然是一个谜。矛盾的是，pMN中抗PLA2R1抗体的主要亚类是IgG4，它被认为不能激活补体。在我们的细胞分析中，pMN患者血清中IgG4的缺失导致突触拓扑素和NEPH1的完全保护不被降解。一方面，从抗PLA2R1阳性患者血清中纯化的IgG4足以诱导补体沉积以及synaptopodin和NEPH1的降解。达到这一效果的纯化IgG4的浓度略高于用整个患者血清进行的测定中IgG4的浓度；另一方面，即使在较高浓度下应用，IgG4缺失血清也不会引起任何作用，并且对PLA2R1没有任何反应性。这表明在分离过程中，其他血清成分的协同作用或IgG4补体激活能力的部分丧失，同时我们确认抗原识别被保留。虽然不能排除其他IgG亚类在某些患者中的作用，但综合起来，我们的数据显示IgG4能够诱导补体活化和足细胞损伤，并且可能不仅是抗PLA2R1抗体的主要同种型，而且也是足细胞损伤的主要原因。以前有人提出，中性粒细胞补体激活可能通过凝集素途径进行，但这一假说的确切实验证据尚未发表。先前支持凝集素途径在原发性MN中作用的数据包括在MN活检中观察到MBL沉积，以及在pMN中肾小球免疫复合物缺乏C1q时C4通常存在的事实。当模式识别分子（PRM）与入侵微生物上的碳水化合物基序（病原体相关模式；PAMP）结合，或与细胞损伤、细胞应激和炎症时显示损伤相关模式（DAMPs）的内源性配体结合时，凝集素-补体途径通常启动。凝集素途径的PRMs之一是MBL，我们观察到添加重组MBL增加补体介导的足细胞损伤，而小蛋白抑制剂SGMI-1和SGMI-2特异性抑制关键凝集素途径激活剂MASP-1和MASP-2，阻断补体激活，保护足细胞免受synaptopodin和NEPH1降解。正如预期的那样，这些抑制剂并不干扰MBL与细胞的结合，因此，凝集素途径似乎是有助于足细胞损伤中性粒细胞。如ELISA和远蛋白印迹实验所证明的，抗PLA2R1-IgG4以钙依赖的方式直接结合MBL，支持抗PLA2R1-IgG4直接激活凝集素通路。我们此前观察到PLA2R1阳性的pMN患者高于PLA2R1阴性的pMN患者，并与完全缓解的几率呈负相关，进一步支持凝集素通路在抗PLA2R1相关pMN、MBL-和masp1血清水平中的作用；另一方面，我们报告了5例具有遗传MBL缺陷的pMN患者。在MBL缺乏症患者中，pMN也会发生，这一事实需要考虑到MBL仅代表激活凝集素途径的几个PRM中的一个：collectins（包括MBL、collectin-L1和collectin-K1）和ficolins（ficolin-1、-2和-3）。这些其他PRM也结合乙酰化糖，甚至在MBL缺乏的pMN患者中也可能参与IgG4诱导的补体激活；然而，MBL缺乏应抑制凝集素途径激活水平，事实上，作者还报告了免疫荧光染色模式的改变，与其他pMN患者相比，这些MBL缺乏患者的肾小球中C4d-沉积较少，但C3-沉积较强。这表明，在凝集素途径能力降低的情况下，替代补体途径在中性粒细胞中变得更加活跃。IgG糖基化模式的改变已在各种疾病中被描述，包括自身免疫性疾病和癌症，以及在衰老中，影响促炎和抗炎特性。在类风湿性关节炎中，半乳糖的丢失被认为使GlcNAc的4-OH基团可用于凝集素结合，从而使IgG分子能够通过凝集素途径激活补体。在本篇文章中，我们发现抗PLA2R1阳性pMN患者的IgG4表现出改变的糖基化模式，特别是在细胞试验中，半乳糖缺乏的IgG4糖型比例增加，并且IgG4的半乳糖缺乏与抗PLA2R1抗体滴度以及synaptopodin和NEPH1降解相关。虽然糖基化模式的改变在PLA2R1特异性IgG4上表现得尤为突出，但与IgG1和2相比，它们既不是特异于PLA2R1特异性的自身抗体，也不特异于IgG4；而与其他肾小球疾病相比，也不特异于pMN。与之前的观察一致，我们也注意到年龄的相关影响。值得注意的是，与年龄匹配的对照组相比，抗PLA2R1阳性pMN患者的改变在年轻患者中尤为突出。综上所述，这些数据表明糖基化改变可能使IgG4亚型的抗PLA2R1自身抗体能够激活补体系统。为了支持这一假说，在细胞分析中，IgG4的去糖基化保护了synaptopodin和NEPH1，在蛋白印迹分析中废除了足细胞上的MBL-和补体结合，并强烈减少了MBL的直接结合。补体系统通过三种激活途径中的任何一种激活，导致MAC（C5b-9）的组装以及过敏毒素C3a和C5a的产生。MN中补体依赖性足细胞损伤主要归因于C5b-9，补体受体C3aR1和C5aR1主要在白细胞上表达，并且已知它们对这些细胞具有趋化和活化作用。在本文中，我们可以证明C3aR1和C5aR1都在足细胞上表达，并且它们的表达是在人体pMN中诱导的。最近在糖尿病肾病的啮齿类动物模型中也报道了C3aR1表达增加，这表明我们的观察可能不是针对pMN的。同时阻断这两种受体可挽救cAMP的减少，我们观察到这是对pMN血清和补体的反应，并改善补体诱导的足细胞损伤。如先前在其他模型中所示，C6缺乏也保护足细胞免受损伤，因此，在抗PLA2R1相关的pMN中，MAC的插入和C3aR1或C5aR1的激活似乎都与补体介导的亚溶解性足细胞损伤有关。值得注意的是，我们在培养的足细胞中没有检测到CR1的表达，以前有报道称CR1在体内足细胞中表达。因此，我们无法分析这种补体调节蛋白的潜在保护作用。对于啮齿动物足细胞和针对除PLA2R1以外的抗原的非IgG4抗体，已经有研究描述了亚溶解补体诱导足细胞损伤的几种细胞机制。据我们所知，我们利用表达PLA2R1的人足细胞和人抗PLA2R1血清或分离的IgG4报道了首个原发性膜性肾病模型。作为足细胞损伤的细胞机制，我们确定了两种不同的蛋白水解途径，导致synaptopodin和NEPH1的部分降解。在我们的体外模型和来自pMN患者的人体活检中，这些蛋白质的减少都可以被证明。这两种蛋白质对维持足细胞的结构和功能至关重要，它们的减少与我们模型中肌动蛋白细胞骨架的改变有关。肌动蛋白细胞骨架对维持足细胞足突完整性至关重要，肌动蛋白应力纤维的丢失与足突消失和体内蛋白尿有关。组织蛋白酶L对synaptopodin的切割先前已被证明是几种疾病模型中蛋白尿的一种机制，其中蛋白激酶a依赖的磷酸化保护synaptopodin，钙调神经磷酸酶介导的去磷酸化使其易受切割。我们的数据与这个模型非常一致，因为钙调神经磷酸酶抑制剂环孢素A保护synaptopodin，C3aR和C5aR抑制也保护synaptopodin，维持正常的细胞cAMP水平。据我们所知，天冬氨酸蛋白酶介导的NEPH1的切割在肾小球疾病的发病机制中尚未报道。之前有报道称podocin在被动和主动Heymann肾病中受到影响，而我们发现podocin没受到任何影响。如上所述，这些啮齿动物模型的中性粒细胞不能重现人类抗PLA2R1相关中性粒细胞的主要特征，可能包括其他细胞机制。此外，我们模型的一个特别优点是，它允许分析自身抗体和补体对足细胞的早期影响，考虑到自身抗体和补体在横膈膜上的密切相互作用，在后期可能影响许多额外的足细胞蛋白。总之，我们的数据支持pMN发病机制的模型，其中三个事件导致足细胞损伤（图10）：（1）针对PLA2R1的IgG4自身抗体的发展（针对该疾病）；（2）免疫球蛋白糖基化模式的改变（可能不是疾病的特异性），使得IgG4自身抗体能够通过凝集素途径激活补体；（3）补体受体C3aR1和C5aR1的上调（可能不是疾病的特异性），这有助于足细胞中的过敏性毒素信号。膜攻击复合物的形成和C3aR1或C5aR1信号在synaptopodin和NEPH1蛋白水解中的调控，分别对维持足细胞肌动蛋白细胞骨架和裂孔隔膜至关重要。
通过尚未确定的触发因素，诱导针对PLA2R1的IgG4为主的免疫。糖基化的改变使这些抗体在与靶抗原结合时能与MBL结合并激活凝集素-补体途径。补体激活导致膜攻击复合物（MAC）的组装以及C3a和C5a的产生。第三次打击，增加足细胞上C3aR1和C5aR1的表达，促进C3aR和C5aR信号传导，降低细胞cAMP水平。C3aR/C5R信号和MAC插入在synaptopodin、NEPH1和dynamin的蛋白水解过程中汇聚。我们的发现具有重要的治疗意义。目前对中性粒细胞的治疗包括最初使用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂的非免疫抑制治疗，以及对严重疾病或持续性肾病综合征的免疫抑制治疗。免疫抑制治疗可减少新抗体的产生，不仅具有相当大的副作用潜力，而且由于先前沉积的免疫复合物的持续存在，通常只能延迟6至12个月才能诱导缓解，因此，阻断凝集素通路是治疗中性粒细胞的一个潜在途径，可以作为目前免疫抑制治疗的替代物或与之结合。一种特异性MASP-2靶向单克隆抗体（narsoplimab，Omeros）目前正在一些其他肾脏和非肾脏疾病的2期临床试验中进行评估，并已进入治疗IgA肾病的3期试验。在IgA肾病中，IgA1上O-连接聚糖的半乳糖缺乏已被证明起重要的致病作用；此外，研究人员在IgAN患者的活检组织中发现MBL，除了诱导抗IgA1自身抗体外，IgAN中半乳糖缺乏的IgA1可能结合MBL和其他凝集素，类似于我们在pMN中观察到的IgG4。总之，我们的研究为补体激活及其效应通路导致人抗PLA2R1相关pMN足细胞损伤的机制提供了详细的见解。我们的数据首次证明，IgG4同种型的抗PLA2R1抗体在与足细胞PLA2R1结合时激活补体系统，并且这种效应是由异常糖基化促进的，该异常糖基化允许IgG4激活凝集素途径。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33351779/
