论文｜安徽省草莓空心病病原菌的分离与鉴定
作者：宁志怨1，伊兴凯1，魏发胜2，钱小强3，孔晶晶1，黄锡桂2，张殿兴3，田峰2
单位：1.安徽省农业科学院园艺研究所; 2.长丰县农业技术推广中心; 3.阜阳市殿兴农业科技有限公司
简介：宁志怨,安徽滁州人,副研究员,博士,从事草莓栽培与育种研究。
基金项目：安徽省中央引导地方科技发展专项“早熟优质草莓新品种与双减增效关键技术的示范应用”(201907d06020002);安徽省农业科学院特色小浆果资源研究与利用创新团队(18C0308);安徽省科技特派员工作站“颍泉区草莓新品种选育与种苗繁育新技术研究”；安徽省农业科学院园艺所岗集生态农业试验示范基地奖励项目(201901q06030007)；合肥市农业行业草莓首席专家工作室和长丰县柔性引进农业农村专家项目。
来源：《安徽农业科学》2020年24期
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草莓(Fragaria ananassa Duch.)属蔷薇科草莓属植物,因其色泽艳丽且富含多种营养成分,是冬季时令且经济价值较高的水果之一,市场需求量较大。近年来,随着我国水果产业的发展,草莓栽培已成为广大农户脱贫致富的重要途径之一。但随着种植面积扩大、重茬年限增加以及长期的无性繁殖,一些草莓新病害逐渐发生并在国内逐渐蔓延开来,如草莓空心病近年来在国内多地包括北京、辽宁、河北、江苏、浙江等全国大部分草莓种植区均有报道,并随着种苗的运输等因素逐渐在国内蔓延开来,造成大量死苗,给农户造成严重的损失,已严重影响我国草莓产业的健康发展。
笔者所在课题组于2019年底起对省内几个主要的草莓种植基地进行实地调查,结果显示空心病在省内部分地区已经发生并开始传播蔓延。目前造成草莓空心病暴发的重要原因是病原菌不清楚和无有效的防控技术措施,针对上述情况,笔者在对安徽省草莓空心病病原菌分离和纯化的基础上,结合病原菌的形态特征、分子鉴定和致病性检测结果,确定安徽省草莓空心病的致病菌,从而为草莓空心病的科学防控奠定基础。
草莓空心病一般在定植现蕾后或育苗期匍匐茎抽生时表现出症状,尤其是现蕾后发病导致农户错过补苗的最佳时间,给农户带来的损失相对较大；在病害发生的中后期,病原菌在短缩茎内大量增殖会导致草莓的短缩茎内出现孔洞且易掰断,故称草莓“空心病”（图1A、D）；另一方面植株的叶片没有光泽,心叶略有发黄,部分植株甚至呈现类似“黄萎病”的心叶扭曲现象（图1C）；病原菌侵染后随着维管束组织向上侵染至心叶的茎尖组织（图1E、F）,三出复叶的叶脉泛红同时老叶叶片边缘干枯等。该病害具有较强的传染性,一旦母株感病可能会导致连接的子苗受感染,给生产上带来潜在的危险。
注:A～C.草莓空心病的田间表现;D.病原菌侵染草莓植株形成的中间空洞;E～F.病原菌侵染感病植株心叶的生长点
图1 草莓空心病
2019年11月底在安徽省阜阳、宿州等地进行草莓空心病的发病情况调查,同时从河北、辽宁省等地寄送的草莓空心病病样中,共采集草莓病株12份。在病株短缩茎顶端的病健交界处切取6～8mm2的组织块进行致病菌的分离、纯化和形态特征鉴定等,具体做法参照宁志怨等的方法。
为了验证科赫法则,将分离到的病原菌对草莓匍匐茎苗进行回接种以确定分离出的培养物是否能在草莓上引起上述病害。通过使用制备的病原菌孢子悬浮液对健康的草莓匍匐茎种苗进行回接种鉴定。首先,将草莓植株上分成2个独立的试验组：空白对照组和病原菌侵染组,每个试验组包含10株草莓苗,每个试验组重复3次。
在病原菌侵染试验组中,在草莓根部浸入每种分离物的孢子悬浮液(2×107～3×107/mL)10～15min,重复3次；作为对照,使用无菌水模拟接种草莓根部10～15min,重复3次。将2组接种的草莓植株分别置于25℃的温室中且相对湿度60%～80%条件下保湿16～18h,然后将其置于相对湿度70%~80%、温度20～26℃温室大棚中,按照当地常规的方法进行管理,直至草莓植株出现症状。
将真菌分离物置于培养基中于25℃下培养6~7d后用于病原菌基因组DNA的提取、种属特异性引物的扩增、扩增片段的回收和测序分析。最后,使用DNAMAN等相关生物软件对测出的序列文件进行构建和编辑。
为了研究分离病原菌的进化关系,使用BLAST搜索与已知病原菌种属特异性序列（ITS和18SrDNA）进行同源性比较。然后,使用MEGA6.0中的Maximum Parsimony Trees进行系统进化树分析。为了比较所获得的真菌序列,来自不同物种病原菌Fusarium solani的ITS和18S rDNA序列被用于该研究。
在来自河北、辽宁省和皖北地区的阜阳、宿州市等地的草莓空心病病样中,随机选取的12株具有典型空心病发病特征的草莓病株用于病原菌的分离和鉴定。结果显示,2个平板被霉菌污染,3个平板未分离出任何病原体。最后一共从感病的植株中共分离出5种病原菌,其中辽宁和河北省各1份,其余均来源于省内。然后使用单孢子法对分离出的病原菌进行分离和纯化。结果显示,在PDA培养基上产生的上述病原菌的菌落均呈白色放射状,表面粗糙(图2A),背面为浅黄色。
在形态学物种鉴定中,将这些分离物在PDA培养基平板上培养,并置于培养箱中培养。将收获的分生孢子用显微镜进行观察。结果显示分离出的病原菌产孢的数量均较多,分生孢子一般具有隔膜,小型分生孢子呈肾形,大型分生孢子呈镰刀型(图2B、C)。表明这些病原菌的分离物在形态特征上与Fusarium solani相似。
注:A.分离出的病原菌在PDA培养基上的形态特征;B.显微镜下菌丝体形态特征;C.病原菌分生孢子的形态
图2 草莓空心病病原菌的形态特征
利用浸根接种法,将上述病原菌产生的分生孢子对健康的草莓匍匐茎苗进行回接种试验,3次重复,以水作为空白对照。在接种30 d后,试验组的草莓植株逐渐表现出一些和田间空心病相类似的发病症状。心叶生长停滞,少量心叶的叶柄上出现明显的发红症状,部分心叶叶边发黄并表现出类似“草莓黄萎病”的心叶扭曲现象(图3A、B)；在较老的三出复叶的叶片上,叶片和叶柄的结合部出现发红并干枯,有1～2片叶片干枯并最终死亡(图3C、D)。随着时间的延长,除心叶外大部分老叶逐渐死亡,心叶仍保持生长停滞,但对抽生的匍匐茎苗影响不大,纵切感病植株的根茎结合部发现有橘红色的变色出现,未抽出的心叶呈焦枯状,这可能是导致感病草莓生长停滞的原因(图3E、F)。
但使用无菌水模拟接种作对照草莓植株未表现出任何发病症状。上述症状和之前在田间采集的空心病病株的症状基本相似(图3A、B)。从上述接种后发病的植株上按照上述方法重新进行病原菌的分离、培养、形态特征检查和种属分析后被重新鉴定为Fusarium solani。重新分离出的致病菌在形态特征上也与来源于田间的病原菌基本一致。
图3 利用病原菌的孢子悬浮液对草莓根部进行回接种试验
按照上述方法从PDA培养基上收集的菌丝体用于病原菌基因组DNA的提取,通过琼脂糖凝胶电泳分析后,所提取的基因组DNA均基本上符合聚合酶链式反应的需要。利用PCR技术对每个病原菌的DNA进行扩增ITS和18S rDNA引物后,上述扩增产物中经电泳分离出约530bp和1300bp的PCR产物(图4)。在对上述特异性DNA条带进行回收、纯化和测序后,结果显示上述序列是基本相同并分成2个独立的组(IS00596-1-NS和IS00596)。然后将这些序列与已经登录在NCBI数据库中的序列进行同源性比对。
根据比对结果,分离克隆出的18S rDNA序列与GenBank登录号EU710826.1、KM096318.1分别具有99.85%、99.77%同源性,ITS序列与GenBank登录号MN504655.1、MN227535.1序列具有100%同源性,这2组序列分别来源于Fusarium sp.和Fusarium solani。
注:DNA Maker为SM0337 (上海生工)；IS00596为ITS序列；IS005961-NS为18S rDNA序列
图4 特异性ITS和18S rDNA引物扩增片段的电泳图谱
在进化树分析中,从GenBank获得的总共18个来源于Fusarium sp.和Fusarium solani的18S rDNA序列和ITS序列(其中包括IS00596和IS005961-NS序列)用于构建进化树。使用MEGA6.0软件中的Parsimony Trees程序进行进化树的分析。18S rDNA系统发育进化树分析结果表明分离出的病原菌的18S rDNA与Fusarium sp.的高度同源。ITS序列进化树的分析结果显示,该病原菌ITS序列和Fusarium solani同源性非常高(图5)。综上所述,根据分离出病原菌的外部形态特征和分子生物学鉴定结果都证明引起草莓空心病的病原菌为Fusarium solani。
图5 利用MEGA软件对病原菌的ITS和18S rDNA序列的进化树分析
病原菌Fusarium solani在培养过程中病原菌的产孢能力较强,能够在短时间内产生大量孢子（图2B）。在利用制备的孢子悬浮液对供试匍匐茎苗的根部进行浸根接种后,供试植株表现为生长停滞,长时间没有新生的叶片抽出（图3D）,同时较老的叶片上三出复叶上叶片和叶柄的结合部最初表现出发红后逐渐干枯,有1～2片叶片首先表现症状并最终干枯死亡（图3C）。随着时间的延长,除心叶外大部分老叶逐渐死亡,剖开病株根茎结合部的维管束组织有橘红的变色,老叶和植株相连的维管束组织变色明显,未展开的心叶已经变成灰色并表现出已被侵染的迹象（图3F）,说明病原菌Fusarium solani已经侵染到老叶、根茎结合部的维管束组织和心叶中。
该研究中该病原菌未能引起维管束组织中形成空洞,这可能是由于匍匐茎苗本身长势相对较弱,接种浓度较高导致植株发病较快。此外,研究中还发现该病原菌能够使母株表现出较为严重的症状,但其抽生匍匐茎子苗均未表现出明显的症状,但与健康的匍匐茎苗相比长势相对较弱。上述情况说明感染该病原菌的匍匐茎子苗在后期草莓栽培中可能具有潜在的风险。最后,在回接种试验中发现感染该病原菌的草莓同时还会引起其他病菌感染导致的并发症,如在较老的叶片上表现症状时还会有细菌和霉菌等协同感染。
综上所述,该研究通过分离出的病原菌的形态特征和分子生物学鉴定结果,认为Fusarium solani侵染草莓并通过根系向上传导并会引起中柱变色，可能是导致草莓空心病的原因。据报道，Fusarium solani在自然界中具有广泛的寄主范围，且已经报道了病原菌侵染马铃薯、黄瓜、核桃、大豆、岭南楝树、北美红橡和甜叶灌木等。上述分析表明病原菌可能来源于上述植物并通过交叉感染侵染草莓，因此在未来的工作中有必要通过不同作物之间的重接种试验来确定该病原菌的可能来源。同时，上述研究也为更好地理解Fusarium solani 感染植物的分子机制提供了依据。
♔采编：夏梦 ♔排版：小同