MiSeq系统(系列6—MiSeq测序流程)

MiSeq测序流程1.解冻试剂盒

以下说明描述如何使用室温水槽解冻试剂盒。注意:您也可以在2 ℃到8 ℃的储藏温度下整夜解冻试剂。储藏在此温度下的试剂最长稳定时间为一周。a.从-25 ℃到-15℃的储藏温度中取出试剂盒。b.将试剂盒放入装有足量室温去离子水的水槽中,淹没试剂盒底部。请勿使水超过试剂盒上打印的最高水位线。最高水位线

c.让试剂盒在室温水槽中解冻,直至其完全解冻。MiSeq v3试剂盒—约60-90分钟。MiSeq v2试剂盒—约60分钟。d.从水槽中取出试剂盒,然后在工作台上轻轻拍打试剂盒,去除其底部的水分。让试剂盒底部变干。2.变性和稀释文库根据您的文库类型需要,稀释文库并使其变性,然后添加可选的 PhiX 对照品(此步骤可在解冻试剂盒期间进行,以节约实验时间)。3.清洗流动槽a.戴上一副新的无粉手套,使用塑料镊子夹住流动槽的塑料盒底部,将它从流动槽容器中取出来。取出流动槽

b.用实验室级用水轻轻冲洗流动槽,直至完全冲洗掉玻璃盒和塑料盒上多余的盐。注意:残余的盐分会影响流动槽在仪器上的放置。如果盐分在成像区域变干,成像也会受到影响。冲洗流动槽

c.小心清洁黑色流动槽端口垫,使用无绒棉巾纸彻底擦干流动槽和小盒,轻轻拍干垫片和相邻玻璃区域。流动槽端口和垫片

d.使用酒精棉清洁流动槽玻璃。确保玻璃上没有条痕、指印以及线头或组织纤维。注意:请勿在流动槽端口垫上使用酒精棉。擦干流动槽

e.用无绒棉巾纸擦干多余的酒精。f.确保流动槽端口中没有阻塞物且垫片在流动槽端口周围位置正确。如果垫片看起来离开原位,请轻轻按回使其安全地置于流动槽端口周围。4.检查试剂盒a.将试剂盒翻转十次以混匀解冻的试剂,然后检查所有位置是否均已解冻。b.检查位置1、2和4处的试剂以确保其充分混匀且没有沉淀。c.在工作台上轻轻拍打试剂盒以减少试剂中的气泡。注意:MiSeq吸管会伸到每个槽的底部以吸入试剂,因此请务必确保槽中没有气泡。d.将试剂盒放在冰上长达6个小时或置于2℃到8℃的温度下,直到准备好设置运行。为获得最佳结果,请立即装入样品并设置运行。注意:这组试剂包含甲酰胺,这种脂肪酰胺可能是一种生殖毒素。吸入、摄取、皮肤接触和眼睛接触都会对身体造成伤害。请穿戴防护装备,包括护目用具、手套和实验室工作服。将已使用的试剂作为化学废物处理,并且遵循当地政府安全标准丢弃已使用的试剂。5.装入样品文库a.当试剂盒完全解冻且可供使用时,您即可将已制备的文库装入试剂盒。b.使用无尘实验室纸巾将标记有Load Samples(装入样品)的槽封箔口擦拭干净c.使用洁净的 1mL 移液器刺穿封箔。d.将 600 µL 的已制备文库注入Load Samples(装入样品)槽,避免接触封箔。装入文库

e.使用MiSeq控制软件(MCS)界面直接继续执行运行设置步骤。6.使用 MCS 设置运行a.从“Home(主页)”屏幕,选择Manage Instrument(管理仪器)。b.选择Reboot(重新启动),重新启动系统软件。c.[可选] 从“Run Options(运行选项)”屏幕中,查看配方、样品表、清单和MiSeqOutput文件夹的文件夹位置。d.从“Home(主页)”屏幕中,选择Sequence(测序),开始运行设置步骤。

6.1Load Flow Cell(装入流动槽)a.抬起流动槽仓门,然后按流动槽锁右侧的释放按钮。流动槽锁打开。打开流动槽锁

b.确保流动槽台是不起毛的。如果存在污垢,请使用酒精棉或者蘸了乙醇或异丙醇的无绒纸巾擦拭流动槽台。仔细擦拭流动槽台面,直到其彻底干燥清洁。c.手持流动槽边缘,将流动槽放置在流动槽台上。将流动槽放入流动槽台

d.轻轻按下流动槽锁以将其在流动槽上关闭。当流动槽锁关闭时,定位销会固定流动槽。流动槽锁锁定时,会发出咔哒声。关闭流动槽锁

e.关闭流动槽仓门。f.选择 Next(下一步)。

6.2Load Reagents(装入试剂)a.将PR2瓶从2℃到8℃的储藏环境中取出。翻转混匀,然后取下盖子。b.打开试剂仓门,拉起吸管手柄直到其锁定到位。c.取出清洗瓶并装入 PR2 瓶。装入PR2

d.将废水瓶中的液体全部倒入相应的废水容器中。e.慢慢降低吸管手柄。确保吸管插入到 PR2 瓶和废水瓶中。降低吸管手柄

f.选择 Next(下一步)。g.打开试剂冷却器门,取出清晰槽。注意:请勿将试剂冷却器门打开过长的时间。h.握住试剂盒带有Illumina标签的一端将试剂盒滑入试剂冷却器直到其卡住。装入试剂盒

i.关闭试剂冷却器门。注意:如果试剂盒与流动槽不兼容,则会显示一条消息。选择 Back(返回),装入兼容的试剂盒,或选择 Exit(退出),返回“Home(主页)”屏幕。j.关闭试剂仓门,选择Next(下一步)。

k.选择样品表(Sample Sheet预先根据建库信息制作并放入指定文件夹目录中)。6.3Review(审核)装入流动槽和试剂后,在启动运行之前应查看运行参数并执行运行前检查。

a.查看实验名称、分析工作流程和片段长度。这些参数事先在样品表中指定。b.在左下角查看文件夹位置。如需做出任何更改,请选择Change Folders(更改文件夹)。完成更改后,请选择Save(保存),然后选择Next(下一步)。c.选择Next(下一步)。6.4PreRun Check(运行前检查)在启动运行之前,系统会检查所有运行组件、磁盘空间和网络连接。

a.若有任何项目未通过运行前检查,则屏幕上将会显示一条消息,说明如何更正错误。有关详细信息,参照MiSeq® 系统指南。b.当所有项目均成功通过运行前检查时,请选择Start Run(启动运行)。警告MiSeq对振动敏感。启动运行后触碰仪器会对测序结果造成不利影响。在选择Start Run(启动运行)后,请勿打开流动槽仓门或试剂仓门或触碰仪器监控器,除非暂停运行。在开始运行前,请确保关闭MiSeq上的所有文件,并且在运行期间中请勿打开文件。6.5簇生成模板生成是根据X和Y坐标位置来定义簇在整个流动槽表面上位置的过程。实时分析(RTA)使用运行的前面几个循环来生成模板。a.单个DNA文库与引物杂交,然后通过聚合酶延伸结合的文库。

b.变性双链DNA,同时洗脱起始的DNA模板,新合成的链共价附着于流动池表面。

c.单分子以随机模式与流动池结合

d.单链分子翻转并通过与相邻的互补引物杂交形成桥,杂交的引物通过聚合酶延伸。

e.桥式扩增,双链形成。

f.变性形成具有两个共价结合的拷贝

g.单链分子翻转以与相邻引物杂交,杂交的引物通过聚合酶延伸。

h.多重桥式PCR扩增。

i.变性,形成单链。

j.反义链被切割并洗掉,留下仅具有正义链的簇。

6.6合成测序Sequencing By Synthesis (SBS)a.阻断游离的3'末端

b.Read1引物杂交到接头序列。

c.引物延伸。

d.变性洗脱测序链,同时解除阻断的3'末端。

e.单链分子翻转并通过与相邻的互补引物杂交形成桥,杂交的引物通过聚合酶延伸。

f.形成双链。

g.变性形成具有两个共价结合的拷贝,正义链被切割并洗掉,留下仅具有反义链链的簇。

h.阻断游离的3'末端,引物杂交到接头序列。

i.引物延伸。

6.7对于混合文库则需要进行Index测序a.单Index Reads

b.双Index Reads

6.8监控运行Sequencing(测序)”屏幕上会在运行的不同时刻显示运行度量。簇生成步骤期间,不显示度量。

度量试剂盒循环强度MiSeq试剂盒 v3循环1-7MiSeq试剂盒 v2循环1-4MiSeq试剂盒 v1循环1-4强度和簇密度MiSeq试剂盒 v3循环8-25MiSeq试剂盒 v2循环5-25MiSeq试剂盒 v1循环5-25强度、簇密度、%PF、产量和质量分值MiSeq试剂盒 v3运行完成时循环 26次MiSeq试剂盒 v2MiSeq试剂盒 v1a.Run Progress(运行进度)— 在状态栏中显示运行进度并列出已完成的循环数。b.Intensity(强度)— 显示每个小区的第90个百分点的簇强度值。强度区域内的图表代表成像小区和成像表面的数量。如果流动槽仅在顶面成像,则会显示单柱图表。如果流动槽在顶面和底面成像,则会显示双柱图表。A 表示两个小区,仅在顶面成像B 表示四个小区,顶面和底面成像

c.Q-score是对碱基读取出错概率的预测。Q-score在循环25次后计算。QScore碱基读取出错的概率Q401/10,000Q301/1,000Q201/100Q101/10d.Cluster Density(簇密度)(K/mm²) — 显示运行的每平方毫米簇数。e.Clusters PassingFilter(簇通过过滤)(%) — 显示基于测量质量的 Illumina纯洁度过滤器的簇通过过滤百分比。此数据仅在循环 25 次后出现警告碱基读取的纯洁度是最大信号的强度除以两个最大信号总和得出的比率。如果在前25个循环中存在一个以上纯洁度值小于 0.6 的碱基读取,则片段将无法通过质量过滤。f.Estimated Yield(估计的产量)(Mb) — 显示针对运行检出的预计碱基数,单位为兆碱基(Mb)。此数据仅在循环25次后出现g.运行完成时,显示“Next(下一步)”按钮。继续之前,查看“Sequencing(测序)”屏幕上的结果。警告“Sequencing(测序)”屏幕一直处于可查看状态,直到选择“Next(下一步)”。选择“Next(下一步)”之后,将无法返回“Sequencing(测序)”屏幕。h.选择 Next(下一步)以退出“Sequencing(测序)”屏幕并继续进行运行后清洗。参照:MiSeq系统(系列2—Post-Run Wash)

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