PCR技术详细介绍

PCR技术能快速特异地在体外复制目的，理论上能将其量极微的（fg DNA）目的基因在较短的时间内（1-2小时）扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不复杂，主要包括模板DNA（目标DNA）加热变性；降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性；72℃条件下，Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应，模板拷贝数都增加一倍，理论上n次循环后，扩增产物拷贝数为2E(n——1)。但在PCR反应后期由于底物的消耗，Taq酶活力的下降，PCR抑制物的增加，PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上30-35个循环，扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高pcr扩增产物的量，可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的PCR扩增，一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。

一、变性

DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。解除条件后，变形的单链DNA可以重新结合起来，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度（Tm）。不同DNA的解链温度不同，取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键，A-T间有两个氢键，因此G-C比例大的DNA片段解链温度高，一般，G-C含量每增加1％，PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间，PCR变性温度选择94℃，变性时间为30秒到2分钟。

二、退火

PCR反应体系的退火其实是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。一般引物是人们根据目标DNA的序列人工合成的，其长度在15-30碱基之间，引物的设计有一定的原则，但完全达到理论要求的理想引物，几乎不存在。通常反应体系中包含两个引物所对应的模板区间的DNA片段。由于引物的浓度大大地超出体系中模板的浓度，所以变性后，系统温度降低，首先是引物与单链模板DNA结合，形成局部双链，而不是原来的两条单链模板DNA再结合形成的完整的双链。

三、 延伸

PCR中链的延伸是有方向的，以引物为起点，从5’端到3’端延伸，这是由DNA聚合酶（Taq酶）决定的。Taq酶具有DNA多聚酶的核心功能—以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以Watson-Crick配对方式按5’—3’的方向，沿着模板顺序合成新的DNA链。Taq酶催化DNA合成的温度以70℃—80℃为宜，此时该酶的Kcat值为150核苷/秒/酶分子，55℃为24核苷/秒/酶分子，37℃为1.5核苷/秒/酶分子，22℃为0.25核苷/秒/酶分子。高于90℃时DNA合成几乎不进行。Taq DNA多聚合酶具有依赖DNA合成的5’端到3’端外切酶活性。但不会影响PCR扩增。Taq酶没有3’端到5’端外切酶活性，所以如果发生脱氧核苷酸的错误掺入时，这种酶没有校正能力。Taq酶对Mg2+离子浓度较为敏感，1.5——2.0mM条件下酶活性最高，许多生物变性剂对酶活性有不同程度的影响。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的两条寡核苷酸引物所决定的，这是PCR扩增的理论关键。