FISH原位杂交实验原理及方法

1. 实验目的

通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

3. 实验用具及材料

Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。

4. 实验方法及步骤

1）探针及标本的变性

（1）探针变性

将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

（2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。

③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

2）杂交

将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

3）洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。

（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。

（4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。

4、杂交信号的放大

（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。

（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。

（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。

（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。

（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。

（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5、封片

可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

6、荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果。