细胞凋亡流式检测步骤
原理：Annexin V 属于 Ca2+ 结合蛋白家族，可与磷脂（PL）发生可逆的Ca2+ 依赖性结合。在健康细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）主要位于质膜的胞质侧，当细胞凋亡开始时，PS 从质膜内部转移至外部，而 Annexin V 对 PS 具有高亲和力，可与暴露在外部细胞环境的 PS 结合。7-AAD（7-氨基-放线菌素D）具有高 DNA 结合常数，并且被完整细胞有效排除，可以排除无活力的细胞。在早期细胞凋亡中，PS 暴露于细胞表面，但质膜不包括 7-AAD。这些细胞用 Annexin V 染色，从而区分早期细胞凋亡中的细胞（Annexin V 阳性，7-AAD 阴性）。在晚期细胞凋亡中，细胞膜丧失完整性，从而允许 7-AAD 进入并与 DNA 结合，同时允许 Annexin V 与细胞膜上的 PS 结合（Annexin V 阳性，7-AAD 阳性） 。然而，该测定法不能区分经历凋亡的细胞和由于坏死而死亡的细胞，在任一情况下，死细胞都会被 Annexin V 和 7-AAD 染色。
实验步骤：
1.制备阳性细胞:选择1盘10cm皿细胞，打开培养皿盖子，放置于紫外灯下照射2小时。或使用碧云天细胞凋亡阳性对照试剂盒提前处理阳性细胞。
2.收集细胞：将待测细胞（包括阴性与阳性对照细胞）的上清分别收集至15mlEP中，使用2mlPBS冲洗细胞，加入1ml不含有EDTA的胰酶，至37°培养箱中消化，至细胞大片脱离皿底。用刚才收集的上清液终止消化后，转移至刚才的15mlEP管中。2000rpm，室温，离心5min，弃上清。
3.清洗细胞：用1ml常温1*PBS重悬细胞，转移至1.5mlEP管中。2000rpm，室温，离心5min，弃上清。
4．细胞计数：使用细胞计数仪进行细胞计数，每组取2*106细胞。
5.染色：使用200ul缓冲液重悬细胞（2*106），所有实验组与阴性对照需要双染，阳性对照需要设置两个染料的单染管。双染管加入5ul Annexin V染料，5ul7-AAD，单染管加入单独的5ul Annexin V染料或5ul7-AAD，标清楚单染染料名称。用手弹匀，避光染色15min。（染色过程中准备流式管和滤膜。打开流式细胞仪，检查鞘液和废液情况）
6.染色完毕后，加入1mlPBS，2000rpm，室温，离心5min，弃上清。再加入100ulPBS重悬，过200目滤网。
7.上机设置：打开SSC，FSC，BB515下的FITC通道，以及7-AAD通道，其他用不到的通道删除。使用log模式，全选A，H，W指标。设置初始读值：一般癌细胞SSC设置180-200，FSC设置180-200，FITC电压值设为280左右，7-AAD设置350左右。右侧设置如下：
上机顺序，1-阳性Annexin V单染管，2-阳性7AAD单染管，3-阴性，4-实验对照，5-实验组……
8.电压及补偿调节：看各自通道的峰图调节电压，使阴性峰的峰尾在102和103之间，峰靠右则降低电压，峰靠左则升高电压。上Annexin V单染管时，调节7AAD-FITC补偿，输入X%，使十字门一二象限没有细胞信号。上7AAD单染管时，调FITC-7AAD补偿，输入X%，使十字门一四象限没有细胞信号。若实验时间有限，来不及调节好补偿。FITC-7AAD和7AAD-FITC都输入1%，以保留补偿门，可在FlowJ软件上再次调节。
9.电压和补偿调节好后，不可再次改变。若电压发生改变，补偿应该再次调节。每管细胞收30000-50000个。
10.按照清洗流程标准清洗流式细胞仪，拷贝数据。
11.FlowJ调节补偿，打开FlowJ的界面，把两个单染管拖入补偿组。自动调节补偿后应用至所有实验组。
根据阴性对照设置十字门，保证一二四三个象限中细胞数小于0.4%。应用阴性对照圈门至所有实验组。输出各组十字门结果至Layouts，合理排列后，调节字体大小与格式，Tiff格式输出。
【整理】刘桐凤