硬核科普 | 小谈 辣椒素和辣椒素受体 的研究，来自一线植物科研人员
导言
我的老友（朱张生），一线植物科研人员，是少有的我所认识的具有极强科研业务素质与能力的青椒。我完全有信心，预见不久将来，他必然大有作为。一切只等时间。前几日，辣椒素受体相关工作拿了诺奖，而朱老友多年从事辣椒素相关研究。花了一方功夫，终于邀请到他，写来一份稿件，详细介绍辣椒素与辣椒素受体的研究工作与进展。与大伙共享，详细如下。-- CJ-陈程杰
写在前面
最近看到诺贝尔生理或医学奖颁发给了两位做感知温度和触觉感受器研究领域的大牛大卫·朱利叶斯(David Julius)和阿登·帕塔普蒂安(Ardem Patapoutian)，感觉实至名归（图1）。1997年DavidJulius发表了采用巧妙方法鉴定出了辣椒素受（TRPV1），从而开启了感知受体研究的新发方法和热潮。笔者研究生和博士后期间从事辣椒素生物合成和调控相关研究，到目前已有9年有余。记得2019年夏威夷大学李庆孝教授到华南农业大学交流访问，我负责到机场接机，在回来的路上李教授问我研究什么的，我说是研究辣椒素生物合成的，他说：“我认识加州大学旧金山分校做辣椒素受体研究的David Julius，我觉得他这项成果未来会获得诺贝尔奖”。果不其然，在今年各大风向标都没有预测到的情况下，有人两年前就预测到了。本文只是简单介绍了辣椒、辣椒素和辣椒素受体研究。
图1
辣椒，中国美食界里信徒遍布的一个存在。从豆瓣酱到老干妈，从麻辣香锅到酸菜鱼，从琳琅满目的辣条到飘满红油的火锅…辣椒，凭借其独有的熨帖食道的能力，自传入中国伊始便在食坛上叱咤了400年。改革开放以来，中国经历了三次辣味冲击波：第一次是水煮鱼，第二次是麻辣香锅，第三次是麻辣小龙虾。在某种程度上如同著名的解放战争，波及面之广，涉及人数之众，改变国人口味之深刻，都是前所未见。经此三大战役，辣椒用重口味改写了中国美食江湖的版图。辣，渐渐变成一种国民口味。我国在辣椒种植面积、辣椒产量、辣椒消费量、吃辣椒的人数等数据上，均居世界第一。辣椒以其独特的辣味在餐桌流行，这种令人痴迷的还得从辣椒素说起。
图2. 丰富多彩的辣椒
辣椒素发现
自从辣椒从野外被驯化到走上人们餐桌已有数千年，辣味影响和改变着人们饮食方式和文化，但是辣椒中的辣味物质人们一直不清楚是什么。直到1816年，德国化学家Christian Friedrich Bucholz（1770–1818）采用溶剂萃取法从辣椒中分离出具有辣味的物质，当时获得的辣味物质纯度较低，一年后Henri Braconnot发现这种从辣椒中分离的辣味化合物和碱能形成盐状结晶，于将命名其为“capsicin”（由辣椒属名Capsicum演变而来）。可惜的是，Christian Friedrich Bucholz两年后便去世了。在首次分离得到辣椒素60年之后，1876年John Clough Thresh (1850-1932)从卡宴辣椒（图3）中获得了近乎纯净的辣椒素晶体，将其称为“capsaicin（辣椒素）”，一直沿用至今。1898年，KarlMicko分离得到纯净的辣椒素并获得晶体。1873年德国药物学家Rudolf Buchheim (1820–1879) 以及1878年匈牙利医生Endre Hőgyes将部分纯化过的辣椒素称为“capsicol”，这种部分纯化辣椒素当与粘膜接触时,会引起灼烧感，也会刺激增加胃液分泌。
图3. 卡宴辣椒和辣椒素
辣椒素从分离、提纯到得到纯品晶体以及应用与临床研究的百年之间，没有人对其结构进行过研究，一直到1919年E.K. Nelson对辣椒素的结构才进行了部分解释。1930年之前，辣椒素一直是以天然产物作为唯一来源，是E. Spath和S.F. Darling首次实现了辣椒素的人工合成。1961年日本岐阜大学Sadayoshi Kosuge 和爱知县西三河事务所Yukio Inagaki从辣椒中分离出类似的多种其他物质，它们同样具有“辣味”的生物学活性，于将这些物质统称为 “capsaicinoids”（辣椒元或者辣椒总碱）。截止目前，在辣椒中发现的辣椒素类似物多达23种。侧链脂肪烃长度、是否存在双键和分支点和辣度不同是造成辣椒素类物质差异的主要原因。但是辣椒总碱中以辣椒素含量最多，其次是二氢辣椒素，降二氢辣椒素等其他类似物相对含量较少（图4）。
图4. 辣椒中主要的5种辣椒素类物质
发现了辣椒素以后，人们开始考虑辣度是什么，到底如何衡量？最开始由于条件限制，为了衡量辣度，1912年美国化学家史高维尔（Scoville）设计一套称为“史高维尔感官测试”（ScovilleOrganoleptic Test）的实验方法来度量辣度。该方法为将被测物一单位的辣椒素溶解到糖水里，然后交给数个人品尝，之后逐渐增加糖水量，直到无法尝出辣味为止，此时糖水量的总和即为被测物的史高维尔辣度单位（Scoville Heat Units, SHU）。我们食用的甜椒因为没有辣椒素，所以辣度为0 SHU，常见的虎皮尖椒所使用的辣椒辣度大约5000-10000 SHU，而小米椒或朝天椒辣度则是5万-10万 SHU。然而，这个试验方法受人的主观影响甚大（比如不太吃辣的广东人和嗜辣的湖南人测试的结果差异很大），所以后人开发出称为“高效液相色谱”（HPLC）的方法来精确量测辣椒素含量。不过由于史高维尔指标的流用已久，所以现今仍常将高效液相色谱的量测值转换为SHU来表示辣椒素含量，辣椒素含量和SHU呈线性关系。总之，其实就是辣椒素含量越高，SHU值就会越高，也就是越辣。
图5. 史高维尔度量（来自网络：www.chilli-hills.com）
辣椒素生物学功能和用途
辣椒起源于南美洲安第斯山脉一带，这里生物多样性丰富，病原菌和哺乳动物多，为了在这种自然环境中生长并成功地繁殖下一代，辣椒也是非常的努力，它们进化出辣椒素这种次生代谢产物，赋予果实辣味（对哺乳动物而言的），可以让其更好的抵御哺乳动物和病原菌危害果实和种子（图6）。
图6. 辣椒素抵御病原菌和昆虫危害（Tewksbury，2008）
辣椒素对于我们人类而言，在医药、化工、食品和军事等领域具被广泛应用（图7），具有很大应用前景。我国是最早将辣椒作为药物使用的国家之一，中医用辣椒治疗胃寒、风湿等症。现代研究表明，辣椒碱具有消炎、镇痛、麻醉和戒毒等方面的功效，其镇痛作用与吗啡等同，但比吗啡更持久，而且不会存在上瘾的不利影响。辣椒碱还可抑制恶性肿瘤的发生，对治疗皮肤病、减肥等也有特殊功效。在海洋中的一些附着生物如藤壶、海藻、贝类等大量附着在船底，由于其数量庞大、生长速度极快，可使舰船航速减慢、燃料增加、加速金属腐蚀、堵塞管道及网箱网眼、使水下设施失衡等，给人类开发海洋造成巨大危害。辣椒素作为驱避剂，具有强烈的驱赶作用，并且不杀死海洋生物，具有明显的生态效益。辣椒作为食品调味料，需要对辣椒进行一些浅加工制成辣椒酱等。但食用这些制品时，其辣椒碱都要经过一个浸出过程，辣椒碱的生物利用率并不高。从辣椒中提取分离出辣椒碱，作为食品加工过程中的添加剂，有利于辣度的控制和辣椒碱的充分吸收利用。辣椒素在军事防暴和防狼喷雾上具有广阔应用，利用辣椒素的强烈辛辣味，可以有效制止暴乱，同时不造成伤害。
图7. 一些辣椒素制品（辣椒素镇痛膏和防狼喷雾）
辣椒素生物合成和调控
从辣椒中分离出辣椒素，并明确辣椒素的结构和生物学活性后，开始步入生物化学时代，人们探索辣椒素的生物合成过程。20世纪60年代末，两个独立的课题组Bennett和 Kirby、Leete和Louden 对辣椒素的生物合成途径进行研究，通过同位素示踪发现：辣椒素香草胺单元的合成前体源自苯丙氨酸，支链脂肪酸源于缬氨酸，前体质香草基胺和支链脂肪酸在辣椒素合成酶（CS）作用下最终生成辣椒素。1979年KazuoIwai采用同位素示踪方法发现辣椒素在辣椒果实胎座中合成。基于同位素示踪的代谢产物，日本科学家们推断一些参与辣椒素合成的酶（PAL，苯丙氨酸裂解酶 ;C4H，肉桂酸水解酶和CoMT，肉桂酸水解酶）。
图8. 研究用的哈瓦那辣椒
进入分子生物学时代，人们开始发掘和鉴定编码辣椒素合成途径关键酶基因。但是，辣椒素是辣椒特有的次生代谢产物，可参考的资料并不多，辣椒素合成相关基因克隆非常苦难，进展也很缓慢。比较重要的进展是Curry等人（1999）想从辣椒中克隆编码辣椒素合成途径PAL、C4H和CoMT的基因，他们用哈瓦那辣椒的胎座文库采用采用同源序列方法克隆了PAL、C4H和CoMT三个基因（图8）。随后，他们通过比较高辣味的哈瓦那辣椒和无辣味材料胎座cDNA转录本差异，克隆到辣椒素合成途径另外两个关键基因Kas和AMT。Aluru（2003）则将支链脂肪酸途径另外两个基因Acl和FatA从哈瓦那辣椒中克隆。相比而言，编码辣椒素合成途径最后一个酶的基因AT3（CS或者Pun1）克隆相对较晚。Stewart等（2005）采用遗传学手段克隆了AT3基因，该基因功能缺失会导致丧失辣味。进入组学时代，更多的辣椒素合成途径相关基因被推测。笔者所在课题组2013年对小米辣胎座进行转录组分析，鉴定到了3个辣椒素合成新基因。Kim等（2014）对CM334进行基因组测序，鉴定出了54个辣椒素合成途径基因，比较基因组分析发现辣椒素合成途径的同源基因在番茄中也存在，我们中国Qin等（2014）对Zunla-1进行基因组测序，也预测到52个辣椒素合成基因。通过对辣椒和番茄的果实比较转录组分析发现，辣椒素合成途径相关基因在果实中表达，而在番茄果实中不表达或者微弱表达，认为辣椒素合成相关基因在辣椒中获得表达是产生辣味的原因（图9）。
图9. 辣椒素生物合成途径及基因（Kim等., 2014）
爱吃辣椒的人们，是不是也时常有这么一个疑惑: 为什么有些辣椒辣的让人怀疑人生，有些则一点辣味都没有？影响它们辣度不同的因素是什么？辣椒在南美洲起源，在起源地区目前发现有35个种，其中有5个被栽培和驯化它们分别是：一年生辣椒Capsicum annuum，浆果辣椒Capsicum baccatum，中国辣椒Capsicum chinense，灌木辣椒Capsicum frutescens，茸毛辣椒Capsicum pubscens。和其他几个栽培驯化种相比，Capsicum chinense特点是极辣（辣椒素含量极高），所有“吉尼斯世界记录”报道的最辣的辣椒“印度魔鬼椒”、“特立尼达莫鲁加蝎子椒”、“卡莱罗纳死神椒”和“Pepper X”都来自于该种，我国最辣的“涮涮辣”也属于该种。但是Capsicum chinense极辣的原因一直不清楚。
图10. 辣椒5个栽培驯化种和极辣辣椒
笔者在华南农业大学园艺学院攻读硕士研究生期间，因为无辣不欢的原因而选择了辣椒素做研究。为了揭示Capsicum chinenes辣椒为什么会这么辣，历经6年开展了一系列实验,从辣椒中克隆到一个辣椒素生物合成的关键转录调控因子MYB31。MYB31可以通过直接调控辣椒素合成相关基因参与辣椒素的生物合成。不同基因型材料MYB31启动子序列变异导致辣椒素含量存在差异。MYB31功能的明确为辣椒素特异在辣椒属中合成的转录调控提供了新认识，其启动子变异为极辣基因型辣椒（C. chinense）遗传进化提供新见解。MYB31启动子的变异可用于开发相应的分子标记用于培育辣度符合需求的辣椒品种。
图11. 辣椒这么辣的原因
为什么有些辣椒却不辣呢？这是由于不能合成辣椒素。目前鉴定到了大量控制辣味有无的位点，发现主要由于辣椒素合成的结构基因AT3（Pun1）、CaKR1或者调控基因MYB31（Pun3）突变所致，导致辣椒素类物质不能合成，或者合成途径的AMT突变导致形成辣味很低辣椒素酯（辣椒素类物质辣度的1/1000）。
最近的一些研究发现，辣味不应该是辣椒的专属。辣椒很近缘的“亲戚”，番茄、茄子和土豆都有辣椒素合成基因，但是为什么它们不辣呢？比较转录组学发现辣椒素合成相关基因只特异在辣椒中获得转录是辣椒产生辣味的原因。也许未来可以通过将调控基因和合成途径基因共同整合到茄科植物，那么有可能创制“辣味”番茄、茄子和土豆。
辣椒素受体的发现
我们常说的“辣味”其实真正意义上不能算一种味觉，医学上认为的味觉是舌头味觉细胞能感知的味道包括：酸、甜、苦、咸、鲜，5种。辣椒的辣味更确切的讲是一种热觉甚至痛觉（很辣），这也是为什么我们身体任何部位接触辣椒后都能感觉到的辣原因。虽然大家已经清楚辣椒素可以激活引起疼痛感的神经细胞，但这种化学物质如何真正引发痛觉当时仍然是一个未解之谜。90 年代后期，美国旧金山加利福尼亚大学擅长受体克隆的 David Julius 通过分析接触辣椒引起的灼烧感，看到了该领域有重大进步的可能性。由于缺乏辣椒素受体的信息，辣椒素受体的克隆困难重重。Julius 和他的同事采用能够感知疼痛的背根神经节细胞构建了一个包含数百万个片段的cDNA文库，这些片段是感觉神经元中的表达基因，可以对疼痛、热和触摸做出反应。他们将构建的神经元cDNA文库划分成不同的组，每个组大约包含16000克隆，瞬时转化到携带特殊荧光蛋白的HEK293细胞，如果某组含有辣椒素受体的文库被转入细胞，采用辣椒素处理这些细胞可以诱导产生荧光。经过大量艰苦的筛选，他们确定发现了一个辣椒素感应基因，该基因编码了一种新的离子通道蛋白，这种新发现的辣椒素受体后来被命名为 TRPV1，并意外发现该受体可以被43℃以上的物理高温激活（图12）。这一伟大的发现，首次呈现了离子通道受体在物理化学刺激间的信号转导作用，即辣椒素等天然化学物质刺激与温度等物理刺激，可通过细胞膜上TRPV1通道统一转化为电信号，从分子层面为我们展现了躯体感受认知的最基础的来源，更新了我们对躯体感受的认知。TRPV1的发现是一项重大突破，为揭开其他温度感应受体开辟了道路。David Julius 和 Ardem Patapoutian 各自独立地使用化学物质薄荷醇来识别 TRPM8 受体（一种被证明会被寒冷激活的受体），随后与 TRPV1 和 TRPM8 相关的其他离子通道被发现。
图12. David Julius 使用辣椒素来鉴定 TRPV1，这是一种由热痛激活的离子通道，使得我们了解温度变化如何在神经系统中诱导电信号。
辣椒素对包括人类在内的哺乳动物体的辣椒素受体都有效，通过神经传导后使其产生疼痛感（灼烧感）。正是上述原因，进化出的辣椒素可以威慑啮齿类动物咀嚼果实的种子。鸟类体内缺乏对辣椒素敏感的受体，所以感觉不到辣味。没有牙齿的鸟类吃了辣椒果实之后，由于无法被消化辣椒种子随鸟粪排出，帮助辣椒种子传播。但是似乎我们人类却对辣情有独钟，尤其是湘川菜的流行将我们带入了一个无辣不欢盛宴。人们吃了辣椒产生灼烧感之后，大脑在接受到这种感觉后，被误导错误地认为“受伤了”。为了安慰“受伤的”身体，神经元会释放出一种叫“内啡肽”的止疼激素，而这种释放，很大程度上会给人类带来愉悦与快感，让人上瘾。痛并快乐着，就是人类的生存哲学，也是辣椒的极致美学。
图13. 鸟类味取食辣椒果实
作者简介
朱张生，男，目前在华南农业大学园艺学院蔬菜系工作。于2012年获得山西农业大学园艺学本科学位，2015年于华南农业大学获得蔬菜硕士学位（导师：雷建军教授），2019年获得华南农业大学蔬菜学博士学位（导师：雷建军教授）。博士研究生期间，到法国图卢兹大学LRSV研究所Jacqueline Grima-Pettenati课题组进行为期一年的联合培养。2019年-2021年到南方科技大学邓兴旺院士课题组从事博士后研究。2021年7月以“高层次人才”引进到华南农业大学园艺学院蔬菜系工作。
主要从事辣椒重要性状形成的分子遗传机理，重点采用遗传学、生物信息学、组学（基因组、转录组、代谢组等）、生理生化和分子生物学等技术发掘和表征控制辣椒重要农艺、品质和抗性的关键基因并阐明其作用的分子机制。以第一作者或者通讯作者在New Phytologist，Horticulture Research等学术期刊发表论文10余篇，克隆了辣椒中首个辣椒素生物合成的关键调控基因MYB31，代表性成果被学术权威组织F1000Prime推荐为必读文章。