剑桥大学JACS：直接观察阿尔茨海默病相关的Aβ42聚集中单原纤维二次成核机制
通讯作者：Kanchan Garai；Tuomas P. J. Knowles
通讯单位：TIFR跨学科科学中心；剑桥大学
图1. 反应网络和跟踪算法。(A)示意图聚合机制：初级成核或预制种子是初始聚合的来源。它们通过从溶液中添加更多单体而延长，并通过二次成核而倍增。(B)TIRF显微镜图像中原纤维的自动跟踪算法的核心是强度的二阶导数矩阵，由给定点周围的强度值计算得出。它的特征值之一沿着原纤维(红线)指向，并被输入到Dijkstra的路径寻找算法中。(C)在17、21和23小时自动跟踪的纤维(青色)叠加在TIRF显微镜图像序列上。所有显示的实验数据均以3 μM的Aβ42浓度记录。
图2. 单个Aβ42聚集体水平的二次成核。(A)二次原纤维(箭头所示)的代表性TIRF显微镜图像由二次生长后的生长产生成核。(B)从3 μM Aβ42图像确定二次成核率的关键参数的时间演变：时间t(青色)和集成原纤维质量(黑色)形成的二次核总数。二次成核率由连接这两个量的比例因子决定。(C)作为单体浓度函数的二次成核速率。凹曲线形状表示饱和行为，KS=4±1 μM。(D)二次成核饱和如何出现的示意图：在低单体浓度下，原纤维覆盖率低并且随着单体浓度的变化而变化；因此，总反应速率也随单体浓度而变化。相比之下，在高单体浓度下，原纤维表面被完全覆盖（饱和），因此覆盖率以及反应速率不再取决于单体浓度。
图3. 单个Aβ42聚集体水平的伸长率。(A)在3 μM Aβ42处选择单个原纤维的时间轨迹，说明停止伸长行为。(B)3 μM Aβ42下的爆发伸长率r+直方图。(C)作为单体浓度函数的爆破伸长率。凹曲线形状表示饱和行为，KE=2.9±1.2 μM。(D)引起饱和的伸长的可能机制示意图。最初的步骤通常取决于单体浓度并在低单体浓度下决定速率，在高单体浓度下饱和，留下与单体浓度无关的第二步，以确定此限值内的速率。(E)平均爆裂伸长率随时间仅显示出轻微的下降，表明单体消耗在此处分析的聚集的早期并不重要。显示的数据记录在1 μM Aβ42处，其中伸长率显示最强的单体依赖性。(F)次级原纤维的伸长率与不同单体浓度下的初级原纤维的伸长率一致，表明子纤维和母纤维生长动力学之间没有显着差异。
图4. 二次成核催化效率的分布。(A)观察数据仅由能够催化二次成核的原纤维的一小部分fcat生成的概率(全局边缘后验)。该图显示大多数原纤维(fcat接近1)具有在相似程度上促进二次成核的能力，并且我们的数据与只有一小部分原纤维(fcat接近0)特别能够促进二次成核的情况不一致。(B)所有初级原纤维的局部曲率和仅在次级事件附近的曲率的直方图。分布的相似性意味着没有证据表明二次成核更有可能发生在特别弯曲或笔直的原纤维片段中。(C)与给定图像序列中原纤维的平均ThT信号强度相比，次级事件附近原纤维的相对ThT信号强度的直方图。值为1的峰值意味着二次成核的位置与相对ThT信号强度无关。
参考文献：
Manuela R. Zimmermann, Subhas C. Bera, Georg Meisl, Sourav Dasadhikari, Shamasree Ghosh, Sara Linse, Kanchan Garai, Tuomas P. J. Knowles Mechanism of Secondary Nucleation at the Single Fibril Level from Direct Observations of Aβ42 Aggregation, J. Am. Chem. Soc. 2021, https://doi.org/10.1021/jacs.1c07228