空间转录组测序或将成下一个热点？10x Genomics已斥巨资垄断行业
2016年，来自瑞典卡罗琳斯卡研究所、瑞典皇家理工学院等研究机构的学者们在《Science》上发文，阐述了一种新的转录组学研究技术，并提出了“空间转录组学”的概念。虽然他们并不是第一个尝试将转录组测序与空间位置之间实现一一对应的团队，但是他们给出的解决方案确实是最完善，最接近商业化的。
这项技术当时并没有造成巨大的轰动，但总有会慧眼识英的企业，比如10x Genomics。2018年底10x Genomics将这项技术收入囊中，并在一年的完善和优化后将其推向市场。
如今的空间转录组学像极了当年的单细胞测序，虽然还处在科研阶段，但是已经可以展望到其未来的发展空间。我们现在已经看到了单细胞测序技术逐渐从完成概念验证进入临床场景，而空间转录组学很有可能会成为单细胞测序之后，又一个闪闪发光的测序技术外延领域。
空间转录组测序有什么作用？
通常进行的转录组学测序过程，是将一群细胞的RNA提取建库进行测序。这种方法在细胞成分单一的情况下有比较高的指导意义，但是当细胞成分复杂，比如检测组织样本时，RNA建库的过程导致所有细胞的RNA被混在一起检测，互相干扰，最终的检测结果只能输出整个细胞群的平均值，数据的精细度大幅降低。与此同时，细胞的定位信息也在建库的过程中丢失，而实际上，位置背景对于了解组织功能和病历变化至关重要。
随后出现的单细胞测序一定程度上解决了互相干扰的问题。不同类型的细胞可以被单独筛选，然后各自建库，进行单细胞测序。但是筛选过程需要将细胞打散，所以位置信息还是无法被完整保留。
芯片上的捕获引物结构
Spatial的空间转录组测序原理
空间转录组测序的关键就在于，解决了空间位置保留的问题。
被放置在芯片区域内的冰冻组织切片在经过H&E染色和成像记录后，会被进行透化处理，释放细胞中的RNA。芯片上的捕获引物的中段设置了带有独特标识的条形码区域。芯片被划分为了数个不同的捕获区域，每个捕获区域中锚定的引物都带有不同的条形码序列。每个区域对应的组织位置会被记录下来，然后再进行测序后，通过条形码将不同区域的测序结果，映射到对应的组织位置上，最终拼贴形成组织样品的空间转录组图像。
相比于常规的测序手段，空间转录组测序有几个明显的优势：
1.将转录组信息与空间信息对应，体现组织内部的异质性：每个区域独特的条形码使测序结果与空间位置形成一一对应关系。虽然暂时还无法精细到单细胞层面，但是这样的区域划分也已经足以展现出组织内部不同区域间的转录组差异。
2.不影响对全组织进行全面分析：芯片上捕获的全转录组在同一个反应中完成测序，能有效降低多次重复实验中的误差。测序结果如果不按照条形码归类，则直接体现的是切片全组织的转录组情况，无需再做单独检测。
3.为进一步的研究提供指导意见：常规的转录组测序，对后续实验的指导仍然停留在全组织层面。而空间转录组测序则可以标识出更有价值的研究区域，引导研究者将组织进一步细分。
10x Genomics入局，强势收购
完成了空间转录组测序的基础研究之后，研究者们迅速创立了一家企业，开始尝试将这一技术量产化。这家企业的名字定名为Spatial Transcriptomics，也就是空间转录组学，可谓是非常简单粗暴了。
这家公司成立之后非常低调，直到被10x Genomics收购，没有进行过企业的宣传，也没有任何融资经历，创始人、发展情况，都一概不知。因此在分析行业之余，也不得不承认10x Genomics的挖掘能力，能够从众多Biotech企业中挖掘出Spatial这支来自瑞典的潜力股。
2018年12月，10x Genomics公司宣布，已收购位于瑞典的空间基因组学技术开发商Spatial Transcriptomics。此时代表Spatial Transcriptomics发言的联合创始人Joakim Lundeberg，正是那篇发表在《Science》的文章的通讯作者之一。对于本次收购，10x Genomics和Spatial双方都认为，Spatial提供的技术基础揭示了细胞间的互相作用，帮助研究者们更加接近生物学的全貌。
Visium平台示例
被10x Genomics收购之后，Spatial的技术平台被更名为Visium，在10x Genomics内部继续孵化。最初，10x Genomics并未公布这次收购的具体细节。直到2019年8月，10x Genomics递交招股书，准备在纳斯达克上市，这一交易的部分细节才在招股书中公开。
根据招股书中的信息，10x Genomics以3860万美元收购了Spatial，并获得了Spatial相关的一系列专利、商标和客户关系。其中仅专利的价值就达到了3690万美元，而其余的有形资产和无形资产总价值仅约166万美元。
产品已经进入商业化阶段
到2019年12月，10x Genomics宣布收购Spatial一年之际，Visium平台正式推出，成为了第一款走入商业化进程的空间转录组产品。
在2020年初的AGBT（基因组技术和生物进展）会议上，10x Genomics表示未来将进一步提高Visium的兼容性，尤其是在测序的同时允许用户在同一样本上测定蛋白和基因表达，以及对于FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样品的兼容。这些新功能都将显著提升Visium平台的应用范围。
就在10x Genomics兴奋的规划自己的前路时，刚刚进入市场两个月的Visium受到了后来者的挑战。就在本次AGBT大会上，ReadCoor也推出了自己的空间转录组测序产品RC2。
ReadCoor的技术基础源于遗传学泰斗George Church团队发明的FISSEQ原位测序方法。这一技术发明的时间更早，早在2014年George Church团队就在《Science》上发表了相关的文章，并随后在《Nature Protocols》上公布了FISSEQ的详细步骤。
以这一技术为基础的ReadCoor，自然受到了一级市场的青睐。A轮融资就获得了礼来亚洲、维梧资本、德诚资本等知名投资机构参与，融资额达到2300万美元。经过几年的潜心研发，ReadCoor在2020年的AGBT大会上正式推出了自己的空间转录组测序平台RC2。在产品发布前夕还收获了兰亭投资领投的2700万美元B轮融资。
Readcoor的测序平台RC2
ReadCoor使用的核心技术FISSEQ是一种荧光原位测序技术。RNA本身很小，直接对组织中的RNA进行测序难度很高。因此FISSEQ在样品制备的过程中会先将RNA反转录成cDNA，并接成环状，然后使用特定的DNA聚合酶（如Φ29）进行滚环扩增（RCA），形成体积较大的扩增子。所有形成的扩增子会被相互交联，以保证其空间位置不会在测序过程中发生移动。这样一来，在测序的每一个循环中对切片进行扫描，就可以将扩增子的序列信息与空间位置相结合，达到空间转录组测序的目的。
相比于Vissium，RC2是个一站式的解决方案，真正将分辨率控制到单个细胞，并且除了RNA层面的转录组研究，其检测的范围还涵盖蛋白质和DNA，实现多组学同时检测。但RC2的缺点也非常明显，首先整套系统价格昂贵，一台机器要40万美元，而且由于高精度的切片扫描需要大量的时间，因此这台机器的通量非常小，单次分析短则一天，多则数日，并且最多同时分析四个样本。这样的通量规模勉强满足科研需求，很难形成规模化的产业。
如果抛开可用性不谈，RC2在检测精度上明显高于Vissium。尽管缺点也十分明显的，由于这一技术还处于起步阶段，RC2仍然毫无疑问的成为了Vissium最大的潜在竞争对手。
更重要的是，RC2目前已经可以支持FFPE样品的检测，但是10x Genomics的解决方案还仅支持冰冻切片。对于更广泛的科研和临床市场来说，FFPE样品的存量更大，应用范围也更广，显然代表着更大规模的市场。
在这一系列原因的推动下，10x Genomics最终决定斥巨资将ReadCoor，这个最大的威胁转化成伙伴。并且RC2与Vissium之间的技术路线有可能会形成互补，将二者的优势结合，形成一款检测精度高，并且可用性强的产品。
锁式探针
10x Genomics的竞争对手还不止ReadCoor一家。另一家公司Cartana也在做类似的产品，使用的方法与Visium和RC2都有些关联。Cartana使用特异性的锁式探针在直链cDNA上实现了滚环扩增。引物上的条形码区域可以保证扩增产物的空间定位准确。但是这项技术目前还无法实现转录组测序，只能根据研究方向设计专门的引物。但是这一方法仍然为Visium平台的发展带来了潜在的竞争压力，10x Genomics也迅速的捕捉到了这一点。
如今这两个竞争对手已经尽数被10x Genomics收入囊中。2020年10月5日，10x Genomics宣布，将以3.5亿美元收购空间多组学平台ReadCoor，同时还表示自己已经在8月以4500万美元收购了RNA分析技术研发企业Cartana。接连两项大额收购，表明10x Genomics已经下定决心，要在空间转录组测序方面走的更远。
市场需求旺盛，同时也期待改进
完成了对ReadCoor和Cartana的收购后，10x Genomics在空间转录组测序市场上，几乎已经没有了对手。如今Visium已经投入市场近一年，国内很多科研解决方案提供商都已经上线了空间转录组学的研究服务。
在科研服务市场上，贝瑞基因、诺禾致源、百迈客、伯豪生物等企业都相继推出了自己的空间转录组测序服务。从我们目前采集到的信息看，整体市场处于供不应求的状态。无论是好奇心驱动，还是确实对研究有重大意义，科研市场对于这一新技术表现出了浓厚的兴趣。
“其实从2019年初，科研市场就已经开始对空间转录组这一技术进行相关的宣传了。大家都觉得这个技术是继单细胞测序之后，基因测序领域的又一重大突破。”诺禾致源的空间转录组业务负责人刘国静介绍到。
“主要的应用层面还是在科研上，患者样品、模式动物样品，现在还发展到植物的样品，都可以做。”百迈客医学业务单元总经理刘敏告诉我们。
Visium主要解决的是转录组，也就是mRNA层面的问题。上一级的基因组，和下一级的蛋白组，目前为止已经有比较明确的解决方案了。细胞的基因组一般来说区别不大，因此全基因组测序，或者外显子组测序，已经组以解决基因组层面的问题，不必要考虑空间信息。而蛋白组层面，免疫组化可以实现蛋白组层面的检测，但是检测效率有限，一般一张切片只能检测一个蛋白靶标，而且检测不同的蛋白需要用特异性的一抗。
由于转录组和蛋白表达之间的相关性，高通量的空间转录组测序可以为进一步的蛋白组检测提供指导意见，帮助研究人员从大量的转录组数据中寻找更可能有价值的蛋白marker。
目前这一产品的定价还比较高，从我们调研的几家信息来看，单个样品的检测价格在4-5万，包括了从样品制备到最终数据分析的全流程。这一高价状态与检测仪器的成本、试剂耗材成本、还有复杂的样品制备过程都有关系。但是随着技术的革新和方法上的不断改进，相信这一技术最终会像NGS一样，成为能够广泛应用的产品类型。
“从我们现在看来，这一产品的降价空间还是比较大的，未来的发展空间也很广阔。Visium现在的功能还仅限于转录组，未来如果能扩展到甲基化，或是其他一些影响基因转录表达的检测靶标上，平台的价值会大幅提升。”刘敏说。
当然在广泛应用之前，Visium也还有很多问题需要克服。
“这个产品用在科研领域，技术上已经相对成熟了，操作难度也不是太高。但是第一，分辨率还有待提升，比如如果能做到单细胞级别，甚至更高的分辨率，就能满足更高层面上的需求；第二未来这个产品想要广泛应用，肯定不能只限于冰冻切片，FFPE样品的检测是一定要克服的。”刘国静说。
刘国静谈到的两个问题，10x Genomics已经在着手解决了。FFPE样品分析预计在2021年上半年推出。精度方面，Visium已经在Spatial的技术基础上发生了明显的提升，从1000多个点上升到了4992个点，未来显然还会继续提升。
对于更深层次的临床应用，刘敏认为不可操之过急：“从长远的角度上看，在临床上的应用肯定是非常有前景的，但可能还需要很长的时间。不止是因为精度和成本方面还达不到进入临床的水平，更重要的是，临床上现在对于转录组的数据积累和研究认知还不够充分。所以价值肯定有，但是短期内很难走到临床层面。”
空间转录组研究将对基因测序领域带来的三大影响
随着二代测序技术的发展成熟，尤其是在成本大幅降低之后，二代测序近两年隐隐有取代PCR、FISH等常规基因检测技术的趋势。比如在今年的新冠肺炎检测是试剂盒中，华大基因开发的宏基因组测序检测试剂盒是最早一批获批上市的检测产品之一。
但是另一方面，虽然测序技术已经趋于完善，但其在临床上的应用场景挖掘却还不够深入。目前临床上最直接的应用场景就是肿瘤伴随诊断和宏基因组检测两大方向，检测目标主要围绕着基因组展开，小到几个基因的panel，大到全外显子检测。但这些毕竟只是基因组层面的信息，需要经过转录-翻译的过程，才能最终体现在肿瘤的表型上。而在转录-翻译的过程中，复杂的调控机制带来的肿瘤异质性，基因组测序更加无从得知。
空间转录组测序的出现为基因测序领域带来了新的机会。无论是对于上游的测序仪行业，还是未来为应用层带来的可能性，空间转录组测序都是个值得基因检测行业重点考虑的新方向。
1、对于科研检测行业：取代PCR-array成为新筛选方法
在科研行业中，针对转录组的大规模研究，研究方法主要以PCR-array为主。PCR-array本质上是通过芯片实现的高通量Real-time PCR过程，根据研究者的需求，可以对要检测的目标基因进行不同panel大小的定制。这种方法在体外培养的细胞样品分析上，可以达到比较好的效果，但是当上升到组织层面，PCR-array无法很好的区分组织的异质性，只能实现混合物的统一分析。
空间转录组测序可以比PCR-array更好的满足科研方面的需求。使用PCR-array的场景往往在于从大量转录组数据中挖掘潜在的可能性。相比于研究体外样品，组织样品更加贴近机体的自然装填，显然具有比体外样品更高的价值。而且空间转录组测序还能从空间维度区分组织内部的异质性，为研究者提供更深度的研究价值。
2、对于测序仪行业：携手落地的新风向
此前我们在测序仪行业的分析中就谈到过，目前Illumina在全球测序仪市场上已经接近垄断地位。未来国产测序仪如果想要突围，与应用层合作落地可能是最好的市场拓展选项之一。切到具体应用场景的产品，往往本身并不附带测序功能，比如单细胞测序、肿瘤伴随诊断等。如果能与这些检测产品合作落地，形成一整套完整的分析体系，就可以为使用者提供一整套完整的工作流程。
这一点对于空间转录组测序产业也是一样的。以Visium为例，Visium本身提供的主要是针对样品的处理方案，包括组织优化试剂盒和空间基因表达试剂盒。而后续的测序环节，则由用户自己选择。如果国产测序仪行业能够针对空间转录组测序进行针对性的优化，甚至直接整合成一整套自动化的处理系统，可能有机会抢占这一部分市场份额。
3、对于医学检验：新增两个维度辅助Biomarker挖掘
虽然如今谈及应用层面还为时尚早，但是空间转录组测序为组织内细胞的细分亚型和空间分布给出了新的分析维度，可能会帮助临床实现更好的患者分子分型。尤其对于Biomarker的挖掘方面，多组学分析中如果可以新增这两个重要的维度，对于药物有效群体的挖掘将带来关键性的指导意义。
刘国静告诉我们，他们已经在实际的工作中接触过一些药企了：“有些药企其实已经向我们表达过了对这个新技术的兴趣，但是具体的合作目前都还在洽谈中。他们的诉求是希望能够通过这项新技术提供的新维度，看能不能发现一些新的标志物，新的功能细胞群体、新的细胞通讯方式等，能够在研发环节上帮助到他们。”
新的技术总会带来新的机会和新的市场。虽然空间转录组测序目前为止商业化才刚刚一年，但是我们已经可以看到这项技术未来在临床上应用的价值。经过先后几次收购，10x Genomics暂时实现了对这一领域的全面掌控，当然我们也希望这一次国内的技术平台能够更快速的跟进项目，实现这一领域的全面突破。
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