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Cell-centred meta-analysis reveals baseline predictors of anti-TNFα non-response in biopsy and blood of patients with IBD
以细胞为中心的meta分析揭示IBD患者活检和血液样本中的抗TNFα无反应基线预测因子

一、研究背景

炎性肠病（IBDs）主要由溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）组成，主要表现为先天性或适应性免疫系统引起的慢性肠炎，但发病机制尚未完全阐明。抗肿瘤坏死因子α（anti-TNFα）治疗的出现是IBD治疗的一项重大突破，已被证明可有效治疗IBD患者。

但是30％的患者对抗TNFα治疗无反应，治疗成本高的同时还伴有不良副作用，并且治疗选择和给药方案是以临床经验为基础的，迄今尚无针对无反应的临床预测标志物，因而治疗前的反应性预测尤为重要。本研究中作者通过以细胞为中心的多队列meta分析来识别结肠活检和外周血样本中的IBD无反应预测标志物，并在外部验证队列中进行了验证。

二、分析流程

三、结果解读

1.不同免疫细胞亚群对抗TNFα治疗特征表达基因集的贡献

以往的活检组织研究显示，抗TNFα应答的特征基因富集在类型广泛的免疫应答中，未直接指向特定的免疫细胞亚群。作者从4项研究报道的6个特征基因集中选入了109个抗TNFα反应相关的差异表达基因（补充图S1），进一步研究其可能的细胞来源。

  • 收集已报道的特征基因集（表1）：

    • UC-A和UC-B特征基因集是在UC患者的两个独立队列中发现的前20个差异表达基因，UC- AB为队列A和B中所有重复的差异表达基因，共包含53个基因。

    • UC-B-knn也来自队列B，但使用KNN最近邻分类算法获得。

    • CDc特征基因集来自CD患者队列的研究。

    • IRRAT特征基因集取自一篇肾移植相关研究。

表1：提供特征表达基因集的IBD患者队列

补充图S1：特征表达基因集在来源队列中的差异表达

  • 分析特征基因集的细胞亚群表达模式：

    • 作者整合了GSE22886和GSE7307两个index数据集的相关GSM样本数据，分析109个特征基因的表达水平，构建特征基因集的细胞亚群表达模式。

    • GSE22886数据集：从人外周血和骨髓中分离出的十二种不同类型免疫细胞，对其进行处理以诱导其活化和/或分化，并分析处理前后的基因表达。

    • GSE7307数据集：Human body index，包括90多种不同组织类型的正常和患病人类组织，作者纳入了其中免疫细胞及正常结肠组织的样本数据。

  • 图1将不同细胞亚群的特征基因集表达谱进行聚类，结果显示3个细胞亚群与抗TNFα治疗无反应有关：

    • 髓系细胞子集表达70％的特征基因，B细胞谱系子集表达30％的特征基因，T细胞和NK细胞基因共同表达30％的基因。只有15％的特征基因在正常结肠组织中高表达，并且其中大多数在B细胞谱系中也高表达。

    • 以上结果显示大多数抗TNFα相关的特征基因在免疫细胞亚群中的表达更高，而非重叠表达的基因主要来自髓系细胞和B细胞谱系子集，表明活检组织内的免疫细胞亚群具有作为基线预测标志物的潜能。

图1：特征基因在不同细胞亚群中的表达水平

2.meta分析鉴定不同反应组间的细胞亚群比例差异

由于抗TNFα反应性特征基因集中包含多种与不同免疫细胞亚群相关的基因，作者猜测这些特征基因的差异表达是由于个体间的细胞亚群比例不同而导致的。作者使用一种反卷积算法估计基线时间样本中的细胞组成，对三个患者队列(UC-A,UC-B,CDc)进行了meta分析。

  • 首先使用反卷积算法估计17种细胞亚群的比例，基于细胞亚群标记基因的表达水平对单个样本进行回归分析，得到样本中每个细胞亚群的估计频率，转换为估计比例（补充图S2）。

  • 为保证下游分析的稳健性，作者仅纳入在至少75％的样本中估计比例不为0的细胞亚群，使用Wilcoxon秩和检验对三个队列分别进行不同反应组间的差异分析，然后通过Fisher确切概率检验对三个队列进行meta分析，并使用FDR对合并p值进行校正。

  • 通过以上分析，作者确定了巨噬细胞和浆细胞在至少两个队列中组间估计比例具有显著差异（P≤0.05）且FDR≤0.05，两个细胞亚群在无反应者中比例均显著更高（图2A），并且以C反应蛋白mRNA水平进行调校后差异仍旧显著（线性模型中P值：0.008 / 0.031、0.021 / 0.869、0.001 / 0.010）。

  • 接着对UC-A和CDc队列中治疗4-6周后的样本重复以上分析，结果显示CD反应组中两种细胞亚群的丰度均显著降低（FDR≤0.05，图2B,C），且治疗后无反应组的两个细胞亚群比例仍显著高于反应组（FDR≤0.05，补充图S3），表明在治疗开始后巨噬细胞和浆细胞丰度仍保持在基线时间观察到的组间差异，并且抗TNFα的成功应答与这些细胞亚群的急剧减少有关，因而巨噬细胞和浆细胞的比例可能可以作为临床上预测抗TNFα治疗无反应的标志物。

补充图S2：3个IBD队列中不同反应组的细胞亚群估计频率

图2：不同反应组间细胞亚群估计比例的差异分析

补充图S3：治疗后两细胞亚群比例的组间差异

3.基线浆细胞比例可以预测抗TNFα无反应

作者以巨噬细胞和浆细胞的比例差异对3个队列的表达数据进行了调校，结果显示与补充图S1相比，调校显著破坏了特征基因集与反应组之间的相关性，进一步根据特征基因集的平均表达水平对样本进行评分，在3个队列中绘制预测反应/无反应的ROC曲线，结果显示调校后数据的AUC值显著降低（平均下降32％，补充图S4）。这些结果表明，特征基因集的预测能力主要基于细胞亚群比例的差异。

补充图S4：调校前后特征基因集预测抗TNFα无反应的ROC曲线

接下来作者在2个IBD患者队列中对细胞亚群比例的预测性能进行了验证，表2展示了患者的临床信息。对于验证队列，以临床和/或内镜评估IBD相关症状的改善以及治疗后（至少14周）是否继续使用抗TNFα药物治疗为标准，对患者进行反应/无反应分组。

表2：3个验证队列中患者的临床信息

首先作者分析了在RHCC接受治疗的16例IBD患者的20份结肠活检样本，对炎症巨噬细胞和浆细胞进行IHC染色，然后对样本反应状态不知情的病理学专家进行细胞亚群丰度的评估（以细胞数量进行0-3分评分） ，并且另外使用ImagePro Premier软件对染色面积进行定量。结果显示无反应组样本中浆细胞和炎性巨噬细胞染色均明显更多，表明二者的丰度与抗TNFα无反应相关（图3A）。

根据评估分数和定量分析结果，对反应组/无反应组进行ROC绘制，结果显示浆细胞的AUC分别为71％和81％，而炎性巨噬细胞AUC 分别为67％和48％（图3B）。

考虑到临床应用的可行性，作者选择易于通过CD138染色识别的浆细胞进行后续研究。在RHCC和TASMC接受治疗的的61例IBD患者组成验证队列2，对其进行了上述的评分和定量，结果显示浆细胞丰度在无反应组中显著更高（P = 0.02和P = 0.0005），并且表现出较好的预测性能（AUC = 71％和74％，图3C）。在高度发炎的样本中（n=20），浆细胞丰度具有更好的预测性能（AUC = 82％和84％，P = 0.005和P = 0.002，图3D）。

以上，通过meta分析预测以及外部患者队列的验证，作者证实了浆细胞丰度与抗TNFα无反应有关。

图3：验证队列中样本的IHC染色及细胞亚群丰度的ROC曲线

4.细胞亚群比例差异掩盖的失调基因网络

组织中细胞亚群比例的不同常常是基因表达分析结果最大的混杂因素，由于两反应组样本间炎性巨噬细胞和浆细胞的丰度差异，作者认为具有潜在价值的生物学信号可能被这种差异所掩盖，所以进一步针对两细胞亚群的差异调校UC-A,UC-B,CDc队列中样本的表达谱，寻找差异表达基因和通路，以探索无法用细胞亚群差异来解释的无反应相关生物学过程。

首先作者通过GSEA基因富集分析和meta分析富集到15条失调通路（FDR = 0.05），在无反应组中均为上调，并与免疫信号和炎症相关（图4A）。最突出的无应答相关通路为My D88缺乏（削弱toll样受体TLR2/4的功能），白介素6信号传导和B细胞受体的抗原激活，三条通路在GSEA-leading edge中占有相当大的比例（分别占基因的64％，30％和26％）。

差异表达基因分析鉴定出166个在至少两个队列中差异表达的DEGs（62个上调和104个下调，P≤0.05），作者使用IPA分析寻找与细胞亚群标志物有关的通路。富集网络结果显示其中一个包含28个基因的网络中同时包括了趋化因子配体7（CCL7）和趋化因子受体2（CCR2）配体-受体对（在无反应组中均为上调）。

已有研究显示CCL7–CCR2轴与炎症反应相关，并且在IBD中上调。在IBD患者的粘膜中，CCL7主要由上皮细胞产生，并与炎症部位的上皮破坏程度相关，同时也由包括浆细胞在内的炎性淋巴细胞产生。而CCR2主要在单核细胞上表达，并介导其募集到发炎的组织中。

值得注意的是，IPA分析结果显示髓系细胞触发受体1（TREM-1）是6个调校后衍生DEG（包括CCL7）的上游调节子，TREM-1在包括单核细胞和巨噬细胞在内的髓系细胞上表达，已充分证明具有促炎功能，并且在IBD模型中阻断TREM-1显示出减轻症状的良好功能。

在未调校的原始数据中，3队列的meta分析显示TREM-1，CCL7和CCR2基因表达在无反应组中均上调（meta-FDR <0.037），作者还分析了TNF相关基因的差异表达，结果显示TNFα和TNFR2在无反应组中也同时上调（图4C），这可能是与TLR信号协同作用后TREM-1激活产生的结果。

与CCL7和CCR2不同，TNFα和TNFR2在调校数据中表达差异减少了，表明TNFα的分泌来自炎性巨噬细胞。综合以上结果，作者认为CCL7–CCR2轴将炎性巨噬细胞募集到发炎区域，分泌TNFα并最终影响了患者对抗TNFα治疗的反应。

图4：调校后IBD患者表达谱的差异表达基因分析及通路分析

5.血液中TREM-1表达量可作为抗TNFα无反应的预测标志物

考虑到血液预测标志物的临床应用价值，作者进一步探索以上研究结果是否可能发掘血液样本中的细胞或分子标志物。来自PaxGene tubes的22例CD患者组成验证队列3，作者对抗TNFα治疗前的全血样本进行芯片分析，获取表达谱数据，分析TREM-1–CCL7–CCR2轴的表达差异，结果显示TREM-1是反应组间唯一差异表达的基因，在CD患者中总体上高表达（平均log2表达量≥11.9），且在无反应组中显著下调（adj.P.val= 0.007，图5A），基于TREM-1表达量的分类器显示出非常高的预测准确性（AUC = 94％，图5B）。

此外，作者对公开数据库中获取的一组UC患者血样表达谱进行了分析，结果显示TREM-1和CCR2的表达水平与IBD活动性（肠镜评估）有关，进一步表明血液中TREM-1–CCL7–CCR2轴的表达是重要的临床非侵入性预测标志物。

图5：验证队列TREM-1的差异表达及其ROC曲线

小结

通过meta分析、细胞亚群比例的评估及表达谱调校后的DEGs筛选和通路分析，以细胞为中心的思路使作者成功发掘出隐藏在细胞组成差异下的生物信号，CCR2-CCL7轴及其上游调节子TREM-1参与抗TNFα反应的机制，且浆细胞和TREM-1可以分别作为活检及血液样本中治疗无反应的预测指标。

由于研究纳入的细胞亚群并不完整，验证队列样本并非根据本研究设计而采集，所以研究结果还需要在更大的标准化临床实验中进一步验证，并且仍需要进行进一步的纵向研究以阐明反应组间独特免疫微环境的机制。

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