技术达人精品课20180117-王华【Q&A】

2018年1月17日的《技术达人精品课》直播课上，小伙伴们的提问非常踊跃，一共收集到的提问共51份，创了直播课提问数新高。鉴于大家提问多，问题基本上集中在几个技术环节上，所以王华老师对大家提出的问题不是一一作答，而是进行了梳理和分类后给出解答。

冰冻切片的制片流程（仅供参考）

1）冰冻切片机温度设定：速冻台温度-35℃，冷冻锤放在速冻台上备用；箱体与组织夹头温度设置为-16~-18℃；组织托放入箱体预冷备用。

2）取材：1.5×1.5×0.3cm，尽量剔除脂肪组织、钙化、骨质等影响切片质量的成分。

3）对组织材块进行编号。

4）使用优质吸水纸将组织表面的水分充分吸干。

5）组织冷冻：组织托放上速冻台，加少量包埋剂，待底部变白但表面未凝固时放上组织，立即用冻锤进行速冻，尽量保持冷冻锤水平，利于修片。

6）粗修：尽量少修，切到有效切面即可。

7）切片：细修数次后切片，切片厚度5~6μm，贴片平整。

8）贴片后立即固定10~20秒，严禁晾干或吹干再固定。

9）流水清洗切片20秒以上，充分洗净固定液。

10）苏木素染液1~2分钟（根据室温调节染色时间），水洗2~3次。

11）入返兰液5~10秒返兰，流水冲洗约20~30秒，充分洗净返兰液。

12）伊红染色液5~10秒（根据伊红染色液的种类和特点调整时间）。

13）95%乙醇1缸5~10秒，无水酒精2缸各5~10秒，抖动玻片促进脱水。

14）透明剂2缸各5~10秒，抖动玻片促进透明。

15）封片胶封片。

16）打印玻片标签，核对编号粘贴标签，交予阅片医生。

17）待诊断医生发出冰冻诊断报告后，取下冰冻组织，室温中复温解冻，4%中性缓冲甲醛固定冰对与冰剩组织。

冰冻固定液配方：

1）AFA：80%乙醇85ml，40%甲醛10ml，冰乙酸5ml。

2）改良型Bouin’s：75%乙醇-苦味酸饱和溶液75ml，丙酮10ml，40%甲醛10ml，冰乙酸5ml，乙酸钠1g。

注意：用改良型Bouin’s固定冰冻切片，须使用碳酸锂作为返兰液，碳酸锂溶液可以快速去除切片中残留的苦味酸残留。

固定时间：

固定充分可以有效保存组织中的成分，避免在染色和水洗过程中组织成分流失。

甲醛对组织的固定是通过交联反应起作用，酸通过化合反应起作用，这两种化学反应速度慢，需要时间进行反应。

AFA和改良型Bouin’s固定至少需要10秒以上。

关于复温：

组织中细胞成分越多间质越少，切片越容易出现碎裂，切片温度就需要调高一些。

组织温度过低时，可以拿到箱体外整体复温。注意不能出现组织解冻现象，冻融后二次冷冻组织内冰晶形成很多。

复温到多少温度合适，得自己多练习，多体会，对不同组织的切片温度找到“感觉”。

以我的经验，当你把箱体温度和组织夹头的温度都设置为-16℃时，基本可以满足大部分组织的良好切片了。

 淋巴结的切片技巧：

1）外周的脂肪尽量剔除干净：对取材医生要有勇气提出合理的要求。

2）多少个淋巴结能同时切在一张玻片上，技术员需要自己进行技术难度评估，对于淋巴结的冰冻切片，技术员自己决定每个组织托放几个淋巴结。

含脂肪多的乳腺组织的切片：

这是有难度的切片操作，切片温度要以非脂肪组织能完整切片为准，保证具有诊断价值的组织尽可能切好为目标。

如果你能预判一个含脂肪很多的组织切片很困难，可以在组织冷冻前，做两张组织印片放到固定液中，与冰冻切片一同染色制片，可以给医生提供更多诊断信息。

毕竟技术员是人而不是神仙，有些组织很难切片，是很难做到完美的，我们能做的就是努力做好，满足诊断的要求吧。