全球首款RNAi药物“诞生”花了20年，未来10年将“爆发” | Nature深度好文

系列：深度综述——RNAi疗法

杂志：Nature Reviews Drug Discovery

亮点：

1）美国FDA批准了首款RNAi疗法，标志着该领域迈入新时代

2）Beckman研究所的3位科学家发表关于RNAi疗法的深度综述，内容丰富（药物设计、研发进展、临床试验、未来挑战）、多图多表，强烈推荐

包含有与特定基因同源序列的双链RNA可引发特异性基因沉默，这种现场被称为RNA干扰。（图片来源：Nature）

1998年，美国科学家Andrew Fire和Craig Mello在Nature[1]杂志上发表了一篇开创性的论文，确定了双链RNA（dsRNA）是线虫中转录后基因沉默（PTGS）的诱因。他们将这种现象称为RNA干扰（RNAi）。

RNAi的发现（图1）解释了植物和真菌中令人困惑的基因沉默现象，并引发了生物学上的一场革命，最终，研究证明，非编码RNAs是多细胞生物中基因表达的主要调控因子。RNAi通路在几乎所有人类细胞中调控着mRNA的稳定性和翻译。

2001年，Sayda M.Elbashir等发表的一篇Nature[2]，以及Natasha J. Caplen等发表的1篇PNAS[3]证实，由21和22个核苷酸组成的dsRNAs能够在哺乳动物细胞中诱导RNAi沉默，且不会引起非特异性干扰素反应。这些小干扰RNA（siRNAs）很快就成为生物学研究中无处不在的工具，因为它们能够通过一段碱基序列轻易地抑制任何基因。

图1 RNAi通路发现和阐明的早期事件 (图片来源：Nature Reviews Drug Discovery)

对药物开发人员来说，siRNAs的效力和多功能性、抑制编码蛋白质的基因的前景以及有望成为“可编程”药物的潜力都非常“诱人”。到2003年，已有很多家公司布局RNAi疗法。

不幸的是，第一次使用未经修饰的siRNAs进行的临床试验产生了与免疫相关的毒性，以及可疑（不确定）的RNAi效应。第二波临床试验使用了系统给药的siRNA纳米颗粒制剂，尽管取得了重要进展（如，首次证实，siRNA纳米颗粒系统给药可在人体内产生RNAi效应），但依然表现出了显著的剂量限制毒性以及疗效不足。这些研发中暴露的问题使得大部分制药公司在2010年代早期退出了RNAi领域，这给RNAi药物的研发带来了资金危机。

不过，尽管面临这些挑战，一些小型RNAi公司和学术研究人员并没有就此放弃。他们吸取了以往临床试验失败的惨痛教训，坚持对触发器设计、序列选择、化学修饰和递送机制进行改进。在这些方面取得的实质性进展，结合更加明智的疾病适应症选择、更好的验证干预途径、更成熟的临床开发过程以及改善的生产制造能力，创造出了一条更加安全、有效的候选RNAi药物管线。

图2 patisiran的治疗机制（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）

2018年8月10日，美国FDA批准Alnylam公司作用于肝脏的siRNA药物——ONPATTRO (patisiran)，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的神经损伤。

hATTR是一种罕见的、遗传性、危及生命的神经退行性疾病，由周围神经系统、心脏、胃肠道和其它器官中转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）淀粉样蛋白沉积引起。患者患有进行性神经病、心肌病、行走障碍和各种其它衰弱症状，诊断后中位生存期为5-15年。

大多数TTR在肝脏中产生。TTR中有>120个突变就能导致hATTR。Patisiran通过沉默肝细胞中野生型和突变型TTR mRNAs来降低血清中TTR蛋白的水平（图2）。Patisiran的批准给hATTR患者带来了新的希望，让RNAi药物系统性递送到肝脏组织在临床上成为现实，预示着RNAi治疗领域进入了新时代。

图片来源：Nature Reviews Drug Discovery

3月7日，来自美国Beckman研究所的3位科学家就“RNAi药物设计和研发方面的关键进展、目前临床管线的状态以及未来的发展前景”在Nature Reviews Drug Discovery[4]杂志上发表了一篇深度综述。

文章介绍了RNAi的机制以及早期发现历史，总结了目前在合成RNAi触发器中使用到的基序、设计规则和化学修饰，讨论了多种药物递送途径，评估了RNAi药物管线的当前临床状态，对比了patisiran和后续候选药物，并分析了RNAi领域未来的机会和挑战。

药物设计与开发

图3 哺乳动物miRNA生物发生、合成RNAi触发过程以及RNAi沉默通路。(图片来源：Nature Reviews Drug Discovery)

为了利用哺乳动物的RNAi通路（图3）对假定的治疗靶点进行有效的特异性抑制，RNAi药物制剂必须克服与药效学相关的挑战（包括靶向特异性、脱靶RNAi活性、免疫传感器介导的细胞毒性）以及与药物动力学相关的、在系统循环、细胞摄取和内涵体逃逸（siRNA从内涵体逃逸到细胞质中可增强RNAi效果[5]）方面的挑战。而这些挑战是通过RNAi触发器的结构基序、序列选择和化学修饰以及递送途径和赋形剂（辅料）的选择和设计来解决的。

结构基序

虽然RNAi通路酶对dsRNA分子的相容性有限制性的结构要求，但科学家们已开发出了一系列具有不同结构基序和功能特性的合成RNAi触发器（图4）。合成RNAi触发器通常是完全碱基配对的dsRNAs或短发夹RNA（shRNAs），总长度在15到30bp之间。短于15bp的dsRNAs会失去参与RNAi机制的能力，而长于30bp的dsRNAs则能够通过激活PKR通路诱导非特异性细胞毒性。

图4  不同类型的合成RNAi触发器具有代表性的二级结构基序以及它们进入RNAi通路的主要机制。(图片来源：Nature Reviews Drug Discovery)

序列选择

2016年，1篇发表在Cancer Gene Therapy[6]上的综述提供了用于siRNA设计的软件包列表，并推荐了使用protocols。通过对其中涉及的一些问题的讨论，综述指出，未来，RNAi药物的开发人员可能需要在合理的靶点周围进行广泛的靶点序列筛选，以确定最佳候选药物。

化学修饰

对RNAi药物来说，化学修饰(组织靶向配体除外)有两个基本功能。首先，它们通过削弱检测dsRNA的内源性免疫传感器的激活，大大提高了安全性；其次，它们通过增强dsRNA触发器抵抗内源性核酸内切酶和外切酶降解的能力，大大提高了效力。除了这些功能外，化学修饰还可以改善序列选择性以降低脱靶RNAi活性，以及改变物理和化学性质以增强递送。

递送赋形剂

dsRNA触发器的化学修饰、大小、亲水性和电荷都对系统循环、外渗、组织渗透、细胞摄取以及内涵体逃逸构成了重大挑战。许多化学赋形剂（辅料）已被开发出来以克服这些障碍，包括纳米颗粒、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物、树状大分子、核酸纳米结构、外泌体和GalNAc偶联蜂毒素样肽（NAGMLPs）。siRNA常见的靶向配体包括适配体、抗体、多肽和小分子（如GalNAc）（表1）。

表1 RNAi药物的递送方法以及赋形剂

数据来源（Nature Reviews Drug Discovery）

给药位置

除赋形剂外，给药方法和给药部位对RNAi药物的生物利用度和生物分布也有深远的影响。临床开发中的RNAi药物涉及的给药方式包括通过静脉注射和皮下注射进行系统给药、通过吸入（肺中）或特定位置注射（如眼内、脑脊液）等方式进行局部给药。

临床产品

目前，除已被批准上市的patisiran外，针对肝脏、肾脏和眼部适应症的多种候选药物正在进行I、II和III期临床试验(表2）；此外，在接下来的两年里，一些靶向中枢神经系统（CNS）和其它非肝脏组织的IND申请“迫在眉睫”。此外，用于RNAi有效载荷（特异性增强）和赋形剂的新技术有望在未来5年内带来新的适应症突破。

当然，需要指出的是，RNAi药物的药物动力学、药效学和毒性限制策略方面仍有很大的改进空间。一些新技术的出现有望实现这一目标，如改善内涵体逃逸的技术、增加RNAi疗法有效性和安全性的抗体偶联技术、降低LNPs毒性的技术、改善递送方式的技术、快速逆转RNAi活性的技术（许多RNAi药物一次给药后疗效持续数周，可能会引发毒副作用）、限制RNAi药物在特定细胞中发挥作用的技术、丰富临床前动物模型的技术等。

但综合来说，目前的进展表明，未来10年，RNAi疗法有非常多值得期待的地方。

表2 部分目前处于临床试验阶段的RNAi疗法

数据来源（Nature Reviews Drug Discovery）

总结

从1998年发现RNAi现象，到2006年两位发现者共同获得诺贝尔生理学或医学奖，再到2018年全球首款RNAi药物获批，这20年的开发历史证明了坚持的力量。毫无疑问的是，随着相关技术的不断进步，未来RNAi疗法会取得更多的突破。

相关论文：

[1] Andrew Fire et al. Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature(1998).

[2] Sayda M. Elbashir et al. Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature(2001).

[3] Natasha J. Caplen et al. Specificinhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate andvertebrate systems. PNAS (2001).

[4] Ryan L. Setten et al. Thecurrent state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nature ReviewsDrug Discovery (2019).

[5] 杨江勇等. 细胞内siRNA传递:应用修饰的细胞穿透肽从内涵体逃逸. 《国际药学研究杂志》（2009）.

[6]E Fakhr et al. Precise and efficient siRNAdesign: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy(2016).

参考资料：

1# RNAi疗法重大里程碑，FDA批准首款hATTR药物Onpattro

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