病原体核酸技术在儿童感染性疾病检测中的发展及应用
摘要▼
分子诊断技术的发展加速推进了儿童感染性疾病病原体核酸检测向高通量、高灵敏度、自动化发展的进程。在临床常用的荧光定量PCR技术之外，多重PCR技术、数字PCR技术、等温扩增技术、微流控芯片的应用使病原体核酸检测在通量和灵敏度上有了显著提升，这些技术配合一体机的使用实现了儿童感染性疾病病原体核酸检测的自动化和高通量化。高通量测序技术可以最大程度获取标本中几乎所有病原体的核酸信息，已逐渐成为临床感染性疾病诊断的重要辅助手段。
由于儿童免疫系统发育尚未完善，感染性疾病成为儿童最为常见的疾病，2013年全球有3.26亿5岁以下儿童死于感染性疾病，占所有5岁以下儿童死亡数的50%以上。病原微生物的早期、快速、准确诊断在感染性疾病的诊断、治疗和预防中起着至关重要的作用。随着近年来分子诊断技术的不断创新，感染性疾病病原体核酸检测技术也取得了快速发展和广泛应用。
一、儿童临床病原体核酸检测现状及挑战
儿童感染性疾病具有病原微生物多样性、复杂性、载量低等特点。目前，病原学核酸检测主要依赖于PCR技术，尤以荧光定量PCR技术的应用最为广泛。荧光定量PCR技术因其实时定量、闭管检测、特异性强等优点，被广泛应用于细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体和病原体耐药基因等临床病原学核酸检测领域。但该技术也存在通量过低、检测灵敏度有限等缺点，不适用于临床多种病原体的同时检测以及特殊低载量病原体样本的检测。同时，国内各级医疗机构感染性PCR实验室自动化程度不高，也限制了该技术进一步的临床应用。自动化、高通量、高灵敏度必然是未来儿童感染性疾病核酸检测的发展方向。
二、儿童病原体核酸检测技术的发展及临床应用
（一）基于PCR技术的病原体核酸检测
为了克服荧光定量PCR技术通量低、灵敏度有限的缺点，目前新开发的临床常见病原体核酸检测技术主要包括多重PCR技术和数字PCR技术。
1．多重PCR技术：
主要应用多重引物，针对不同的病原体核酸或耐药基因进行特异性扩增，根据不同病原体扩增产物的长度差异来判断何种病原体感染，也可以同时检测同一样本中的细菌、病毒、支原体等临床常见病原体及其耐药基因。该技术早期主要通过凝胶电泳和毛细管电泳人工来判断结果，如黄烈等建立了多重PCR技术同时检测流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等9种儿童常见的呼吸道病毒，最终通过凝胶电泳分析PCR产物大小来判断病毒类型；张海邻等建立了同时检测病毒、衣原体等11种儿童常见呼吸道感染病原微生物的多重PCR体系，检测结果通过毛细管电泳法进行分析。但该技术存在扩增产物易污染的缺点。近几年一些企业已将PCR扩增和毛细管电泳做成一体机用于儿童感染性疾病的病原学检测，封闭检测降低了核酸污染机率，并通过机器判读结果，减少了检验人员的操作误差和工作量。一体机使PCR技术摆脱了场地和荧光定量PCR仪的限制，更适合门诊或基层儿童感染性疾病病原学核酸检测的快速普及。
2．数字PCR技术：
包含列阵数字PCR、磁珠乳液扩增方法（beads，emulsion，amplification，and magnetics，BEAMing）数字PCR和微滴数字PCR。其中微滴数字PCR应用最为广泛，该系统要求在传统PCR扩增前把测试样本分割为成千上万的水包油微滴，分割后每个微滴成为1个独立的PCR反应体系，可以实现病原微生物的绝对定量，将PCR灵敏度提升了10~100倍。在儿科感染领域，微滴数字PCR主要应用于细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原微生物的精准定量检测，如结核杆菌、HBV、HIV和疟原虫等，进而指导临床诊断和治疗[10,11,12]。
（二）基于等温扩增技术的病原体核酸检测
等温扩增技术可以实现恒定温度下扩增目标核酸片段，不仅避免了PCR反应的升、降温过程，缩短了扩增时间，而且摆脱了PCR仪的限制，能更好地适用于基层医院。依据等温扩增酶及引物设计的特性，等温扩增技术主要包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、实时荧光核酸恒温扩增（simultaneous amplification and testing，SAT）、酶促重组等温扩增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）。
1．LAMP技术：
在病原体核酸的6个区域设计4条引物，通过一系列的链置换扩增反应来实现病原体基因片段的扩增，由于在体系中加入了Mn2+钙黄绿素复合物，扩增反应产生的大量焦磷酸根离子可与Mn2+结合释放钙黄绿素，因而有利于反应结果的观测，使扩增和检测只需一步便可完成，大大提高了检测效率。但LAMP技术难以区别非特异性扩增和极易受污染影响而产生假阳性结果。
2．SAT技术：
将病原体靶RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），再利用T7噬菌体酶将cDNA转录为RNA，通过颈环RNA探针识别RNA产物释放荧光，然后产物RNA不断重复上述过程，由于每个循环可放大100~1 000倍荧光信号，其灵敏度至少可以达到101CFU/ml，优于荧光定量PCR技术。同时，SAT技术的靶标为RNA，可提示以DNA为核酸的病原体的现症感染，目前在儿科感染领域已广泛应用于儿童肺炎支原体和结核杆菌的诊断和疗效监测。
3．ERA技术：
该技术可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，样本的处理只需吸取200微升的细胞悬95℃水浴2分钟作为模板，反应体系需置于荧光定量检测仪中进行，设置温度为37℃，扩增反应可以在20分钟内完成，观察荧光定量检测仪显示的扩增曲线判读检测结果。
该产品现处于科研品，是一种恒温核酸扩增方法，灵敏度比PCR高10-100倍，可以在恒定的低温条件下进行，而且用时在30分钟以内，并且检测范围涵盖130种支原体，是一种比较理想的支原体检测方法。
（三）基于基因芯片技术的病原体核酸检测
基因芯片是将特异的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，与目的片段进行识别和杂交，通过特定的检测系统和分析系统进行结果判读。根据检测靶标的不同，基因芯片主要包括DNA芯片和RNA芯片。近年来儿科感染性疾病病原体检测领域发展最快的是微流控芯片技术。核酸检测微流控芯片将不同的实验室系统缩微在玻璃或者塑料基质上，在微米级的尺度上构建出液流通道、核酸提取池、逆转录和PCR扩增池、杂交池等部件，整合了样本处理、反应、检测的全部过程，可以实现高通量检测多种病原体或进行病原微生物的分型，但目前尚存在单次检测样本量过低的缺点。微流控技术在检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒等儿童常见腹泻病毒方面的应用已有文献报道，未来该技术有望为儿科感染性疾病的病原学检测注入新的活力。
三、结语与展望
分子诊断技术的发展加快了儿童感染性疾病病原学诊断的进程。PCR技术依然是儿童感染性疾病病原体核酸检测的主要检测方法。微流控技术可以实现病原体核酸检测的高通量、自动化，适合临床儿童感染的多种病原筛查，有望显著提高儿童感染性疾病病原学诊断的能力和效率。可以预见，分子诊断技术推动下的儿童感染性疾病病原体核酸检测技术未来必然朝着高通量、自动化的方向发展，成为感染性疾病诊断的主要方法。