PACE蛋白定向进化系统介绍

这是医业观察公众号的第1011-3期文章
作者：坛毛肚
来源：毛肚吃狗粮的笔记本
PACE蛋白定向进化系统介绍
Phage-Assisted Continuous Evolution (PACE)，噬菌体辅助连续进化系统，是由DavidR. Liu实验室在2011年发表的一项利用噬菌体和宿主大肠杆菌连续共培养策略来进行蛋白质定向进化的系统。
在逻辑层面，这套系统的原理是：将感兴趣的蛋白质或者酶（POI）的编码核酸序列放进噬菌体中，在侵染大肠杆菌后利用其细胞内的易错体系产生POI突变体文库，只有符合预期进化方向的突变体才能被保留，并继续侵染大肠杆菌；同时，利用一个液路控制系统使以上步骤不间断的重复进行，直到得到理想突变体为止。
简言之，这套系统通过改造生物学组件，耦合了POI核酸序列和功能的关系以及噬菌体依赖大肠杆菌复制存活的机制。
接下来详解PACE系统
生物学原理。
所需要理解的基本要点：
a.噬菌体
此系统使用的是温和噬菌体M13，在宿主大肠杆菌中复制，但不会裂解宿主；经过改造，去除了M13基因组中的gⅢ基因，此基因是M13侵染宿主的必须原件；之后，在此位置用POI代替，也就是在gⅢ启动子调控下转录和表达POI。（要点：POI在噬菌体中携带）
b.宿主大肠杆菌
经过改造，此系统使用的宿主大肠杆菌会转录和表达M13噬菌体所缺失的gⅢ基因，要点：大肠杆菌中gⅢ基因的转录和表达强度是由POI的活性决定的；此外，宿主大肠杆菌装配有易错系统，在阿拉伯糖操纵子调控下，诱导表达若干个酶，他们可以引起宿主内所有核酸在复制过程中发生突变。
c.POI活性是如何决定gⅢ基因的转录和表达强度
这种生物学事件的逻辑耦合是case by case设计的，目前可以完成的蛋白类型包括：核酸聚合酶序列特异性改变、DNA结合蛋白序列特异性改变、蛋白质可溶性改变、蛋白酶切割序列特异性改变、蛋白质互作特异性改变、基因编辑特异性改变、翻译过程中非天然氨基酸耐受性改变等。
这里以核酸聚合酶序列特异性改变为例，具体讲解。
目标：让T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）识别T3启动子序列。
步骤一：进化起点选择
这个实施例中最理想的情况是T7 RNAP 是唯一的“变量”，但实际上出现了两个问题：第一，这个人为构造的系统会“进化”其中所有的原件；第二，进化的目标和起点之间的距离太过遥远，系统始终无法找到进化“方向”。（比喻：让猩猩直接进化成智人很困难）
为了解决以上问题，首先，在不连续的条件下总装了所有“原件”，让原件之间互相“磨合”，发生一些适应性的突变，结果发现T7 RNAP P314T会发生突变，并且活性与野生型没有显著性差异，故选择此突变为POI的起点；其次，经过实验发现无法直接使用T3启动子序列与T7 RNAP进行连续进化，得不到有效突变体，所以将T3和T7启动子进行杂化，让T7 RNAP对目标不觉得那么陌生（比喻：先将猩猩进化成古猿）。
步骤二：系统设计
此系统主要是由蠕动泵控制，组成一个噬菌体与大肠杆菌共培养系统。
从左至右，C端持续补充大肠杆菌培养基，在B瓶中持续培养大肠杆菌，在两个A中平行进行噬菌体POI的进化（两个重复实验），由两个针筒向A中供给诱导剂阿拉伯糖。
系统的实际情况：
所有组件都是实验室常用设备和耗材。
经过以上操作，此系统可以正常启动“进化”。
步骤三：进化结果
在每个时间点从系统中采样，并进行测序和活性测试，结果发现在两个独立的进化池中产生了非常多的突变组合，他们产生了不一样的进化路径，但在终点192小时，产生了5个共有的点突变，并且对活性有影响。
这为在时间尺度上研究酶进化的动态过程提供了前所未有的便利。
最终，在两个进化池中都得到了可以识别T3启动子的T7 RNAP。
此外，研究者还使用PACE系统进化出可以启动非GTP的转录起始位点的T7 RNAP，并且活性与野生型相当。
步骤四：一些重要参数
此实施例耗时8天，对POI来说，大约进行了200轮进化，噬菌体被稀释10的167方倍，复制约555次，在终点得到带有11个点突变的活性突变体。
近日，研究者应用PACE系统对神经调节剂进行了定向进化，使其可以切割非靶向蛋白序列。
首先，也是最重要的，是建立蛋白酶活性（POI）与噬菌体复制能力之间的逻辑关系。
这里使用了T7 RNAP的自抑制机制，将T7 lysozyme通过一个linker与T7 RNAP连接，linker的序列为蛋白酶目标识别序列。
当T7 RNAP linker lysozyme复合物完整时，T7 RNAP没有转录活性；
当linker被蛋白酶水解，lysozyme释放，复合物解散，T7 RNAP活性恢复。
进一步，为了排除进化得到的蛋白酶产生的脱靶，此实施例引入了负向筛选机制。
将linker设计为不希望被切割的靶序列，同时将gⅢ修改为gⅢ-negative，一种gⅢ的截短体，其具有显性负性能力，即如果出现了脱靶切割的情况，此类population不会继续复制。
为了验证负选择机制的可行性，研究者对X蛋白酶实施了进化。
X蛋白酶的天然底物至少有6种，目标是保留其中的两种底物特异性，降低其他4种的特异性。此处为了丰富突变体库，先使用了不连续进化的方法PANCE，可以在96孔板中高通量的、严谨性可调的产生突变体文库。
最终产生了X突变体4130B1，其相较于野生型，对Ykt6的活性提高了1.5倍，对VAMP1、-2或-3的活性降低了700倍；以及突变体5010B1对VAMP1的催化效率降低了85倍，对VAMP4提高了2.5倍。
这些结果验证了PANCE阳性和阴性双重选择系统进化系统的选择能力。
之后研究者还对其他两种蛋白酶实施了进化，改变了他们的底物特异性。
总结与展望
1，PACE和PANCE系统的进化能力已经接近“全自动”化，这在商业应用转化中很有优势；
2，此系统可以开发为自动化设备，类似于AKATA，并配以耗材和kit，向用户赋能；
3，需要开发更直观、便捷的表征方法来检测进化的实时进行程度；
4，在研发流程上，分子生物学 生物信息学 结构生物学的整合模式已经非常明显且有效；
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