易基因 | 植物DNA甲基化专题 | NAR：拟南芥AtHDA6与着丝粒周围DNA甲基化关系研究
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本公众号将推出植物DNA甲基化研究系列专题，物种涉及拟南芥、玉米、油棕等，敬请持续关注！
首先给大家分享关于拟南芥的DNA甲基化研究，本研究成果由香港中文大学生命科学院张守栋博士和林汉明教授联合香港大学李祥教授以及中国科学院华南植物园罗鸣等课题组在Nucleic Acids Research上发表，多单位合作利用WGBS、ChIP-seq等表观组学技术揭示了拟南芥组蛋白去乙酰化酶AtHDA6参与着丝粒周围（pericentromeric）区域DNA沉默的机制，即HDA6作为组蛋白标记H3K18ac的eraser酶，可以阻止DNA 去甲基化，进而维持着丝粒周围区域DNA甲基化状态。
标题：AtHDA6 functions as an H3K18ac eraser to maintain pericentromeric CHG methylation in Arabidopsis thaliana.
期刊：Nucleic Acids Research
2021影响因子: IF 16.971/Q1
发表时间：2021.08.17
方法：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、ONT DRS测序、生化活性检测等
研究摘要
由高拷贝数串联重复（tandem repeats）序列和转座因子（transposable elements）组成的着丝粒周围DNA（Pericentromeric DNA）通常通过DNA甲基化和组蛋白修饰沉默以维持染色体的完整性和稳定性。尽管已知组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDA6）参与着丝粒周围的沉默，但其机制尚不清楚。而ROS1（Repressor of Silencing 1）是最早发现的DNA去甲基化的基因，组蛋白标记H3K18ac（H3 lysine 18 acetylation）是DNA去甲基化的先决条件，需要H3K18ac的去乙酰化来维持全基因组DNA甲基化状态，抑制常染色质扩散并沉默潜在有害的基因组区域，例如转座子（transposons）和重复序列（repeat sequences）。此前研究已鉴定出组蛋白乙酰化H3K18的writer酶，但H3K18ac的eraser酶仍然未知。
本研究通过全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq），绘制了野生型和HDA6突变株中差异DNA 甲基化和组蛋白标记H3K18ac的全基因组模式图谱。结果显示HDA6突变株中的着丝粒周围CHG 低甲基化由DNA去甲基化酶介导，而非此前认为的由DNA甲基转移酶介导。DNA去甲基化酶可以识别H3K18ac标记，然后被募集到染色质中。使用生化分析研究表明HDA6 可以作为H3K18ac标记的eraser酶，以阻止DNA去甲基化，进而维持着丝粒周围DNA的沉默。此外，ONT DRS测序 (Oxford Nanopore Technology Direct RNA Sequencing, ONT DRS) 结果显示， H3K18ac富集和CHG低甲基化的HDA6突变体中显示出具有转录活性的着丝粒周围DNA。
材料和方法
（1）植物材料
在研究中使用野生型C24、ROS1-1、ROS1-1&HDA6-9、ROS1-1&HDA6-10等4种不同基因型的拟南芥，将种子用50%漂白水和0.1% Triton-X100进行表面灭菌10分钟，随后用灭菌的双蒸水（ddH2O）洗涤五次。
将种子播种在培养皿中补充有1%蔗糖的1/2 MS（Murashige和Skoog）培养基上。将每个培养皿分成四组，每组播种不同基因型的种子。之后将播种的种子在4℃温度下分层4天，分层后将种子在22℃以下以光照环境暴露16小时和黑暗环境暴露8小时循环生长12天。将获得的幼苗用于基因组DNA提取和WGBS/ChIP-seq实验。
（2）由DNA甲基化和组蛋白修饰介导的染色质动力学原理（图1）
图1
实验结果
（1）HDA6突变逆转ROS1-1突变表型，导致DNA低甲基化
由于ROS1是一种DNA去甲基化酶，ROS1基因突变会导致全基因组DNA超甲基化。为了验证这种ROS1-1突变表型是否像此前研究报道的可通过HDA6突变逆转来实现，研究人员在4种不同基因型的拟南芥进行了WGBS测序分析，包括野生型C24、ROS 1-1突变株和两种在ROS 1-1环境下培养的HDA6突变株（ROS1-1&HDA6-9、ROS1-1&HDA6-10）。结果显示ROS1-1&HDA6-9和ROS1-1&HDA6-10突变株均显著逆转了由ROS1突变导致的CG、CHG和CHH位点超甲基化（图2A）。
分析ROS 1-1突变体之间的差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMR），结果显示：在ROS1-1&HDA6-9/ROS1-1和ROS1-1&HDA6-10/ ROS1-1中发现的CG低甲基化DMR比例远高于C24/ROS1-1（图2B，左图），CHH超甲基化DMR可以在ROS1-1和HDA6双突变中恢复到正常的甲基化水平（图2B，右图），而CHG低甲基化DMR则显示相反模式（图2B，中图）。HDA6突变的特异性CHH低甲基化DMR主要分布在富含H3K9me2标记的转座因子（transposable element，TE）（图2C和D，右图），表明ROS1突变通过HDA6突变中增加的H3K18ac标记活化了其他 DNA 去甲基化酶，因此其他DNA去甲基化酶也可能通过HDA6活性来进行调节。此外，CHG低甲基化DMR的聚类分析（cluster analysis）揭示了ROS1和HDA6之间的共同靶点，其中大部分位于启动子和基因间区域（图2C和D，中图），这与此前研究报道一致。大多数HDA6突变相关的CHG低甲基化DMR也分布在TE区域（图2D，中图），证实了组蛋白乙酰化修饰对DNA去甲基化酶活性至关重要。将ROS1-1&HDA6-9/ROS1-1和ROS1-1&HDA6-10/ROS1-1中的CHG低甲基化DMR与C24/ROS1-1中的CHG低甲基化DMR进行差异分析，结果显示CHG低甲基化DMR主要分布在着丝粒周围（pericentromeric）区域（图3A），表明HDA6主要靶向着丝粒周围区域的TE和重复序列区域。经多次重复验证分析，证实了ROS1-1＆HDA6双突变体中着丝粒周围区域的CHG低甲基化由DME（DEMETER）活性和HDA6功能丢失引起。
图2
图3
（2）HDA6是组蛋白标记H3K18ac的eraser酶
组蛋白标记H3K18ac是DNA去甲基化的先决条件，针对上述分析结果，研究人员提出一种假设：HDA6可能通过其对组蛋白标记H3K18ac的去乙酰化活性，阻止DNA 去甲基化，维持CHG甲基化。为了验证这一假设，研究人员使用H3K18ac特异性抗体对野生型C24、ROS1-1、ROS1-1&HDA6-9、ROS1-1&HDA6-10这4种不同基因型的拟南芥样本进行ChIP-Seq实验。将双突变体和ROS1-1相比较，H3K18ac富集的差异peaks主要集中在所有五条染色体的着丝粒周围区域（图3A，环e和f），这些区域与ROS1-1&HDA6双突变体中确定的CHG低甲基化区域对应（图3A，环b和c），支持HDA6在着丝粒周围异染色质区域充当H3K18ac标记eraser酶的假设。
用纯化重组和突变型（由HDA6-9突变等位基因的cDNA构建）的全长HDA6蛋白来证实HDA6的eraser活性。从大肠杆菌中纯化的野生型HDA6蛋白显示出对H3K9ac和H3K18ac的去乙酰化活性，而突变型HDA6蛋白未显示出其去乙酰化酶活性。另外，从稳定转基因拟南芥中纯化的3xFLAG标记全长HDA6在H3K18ac和H3K9ac中显示出高去乙酰化酶活性（图4）。这一结果与此前研究报道的HDA6哺乳动物同源物相似，表明在真核细胞中HDA6蛋白表达可能具有特异性的翻译后修饰（posttranslational modifications），从而增强H3K18ac的去乙酰化活性。
图4
（3）HDA6对染色质转变和沉默至关重要
以往对HDA6-6和HDA6-7的研究表明，HDA6功能的丢失不仅影响核仁显性（nucleolar dominance）并活化核仁形成区（nucleolus organizer region，NOR），而且还活化了组成型着丝粒周围异染色质区域（constitutive pericentromeric heterochromatin regions）。将HDA6的组蛋白去乙酰化鉴定为阻止异染色质区域活化的主要模式，但没有明确指出该酶的靶标。
本研究鉴定出H3K18ac是HDA6维持着丝粒区域CHG甲基化的关键靶点。为了进一步探索H3K18ac富集和CHG甲基化是否可以阻止异染色质活化，研究人员利用ONT DRS测序来分析ROS1-1和HDA6双突变体中组成型异染色质区域活化的TE和重复序列，结果显示在CHG和CHH位点中，DMR的分布模式与组蛋白标记H3K18ac的存在和基因表达水平相关，但在CG位点中不相关(图5)。而此前已证实H3K18ac富集与CHG甲基化高度相关(图3A)。这些结果表明CHG甲基化与H3K18ac去乙酰化高度相关，可能影响相应基因组区域的表达。
图5
为了验证着丝粒周围区域中活化的基因表达与H3K18ac富集和CHG低甲基化之间的关系，研究人员使用J-browse对来自所有五个染色体的着丝粒周围区域采集了一些例子进行简要说明（图6），所有例子都支持HDA6功能障碍促进H3K18ac富集和着丝粒周围区域CHG位点低甲基化。这些数据进一步证实了HDA6在维持异染色质状态中起着重要作用。
图6
易基因小结
在本研究中，作者利用WGBS、ChIP-seq、ONT DRS测序、生化活性检测等多组学方法, 证实拟南芥组蛋白去乙酰化酶AtHDA6能够有效发挥组蛋白H3K18ac的去乙酰化作用，阻止DNA去甲基化酶接近甲基化的DNA，从而维持着丝粒周围CHG的甲基化水平。
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文献来源：DOI: 10.1093/nar/gkab706
原文解读：