小伙伴们，大家好。2021年诺贝尔生理学或医学奖被授予加州旧金山大学生理学及分子生物学的David Julius教授和美国Scripps研究所的Ardem Patapoutian教授，以表彰他们在感知温度机制（TRP通道）及触觉机制（PIEZO通道）人体感受器领域重大科学成就。今天带给大家的是一篇Ardem Patapoutian教授今年2月发表于Cell（IF=41.582）上的文献解读，题目是“A role of PIEZO1 in iron metabolism in mice and humans”。该论文将巨噬细胞机械转导与铁代谢联系起来，并确定了非洲裔美国人铁水平升高的遗传危险因素。铁超载会导致器官损害，并引发关节炎、肝损害和心力衰竭。1%-5%的个体存在铁水平升高；然而，存在铁超载监测不足和诊断不足。影响铁稳态的遗传因素正在出现。遗传性干瘪细胞增生症是一种罕见的与机械敏感的离子通道蛋白PIEZO1突变相关的疾病。本研究中作者发现，在小鼠中，GOF PIEZO1等位基因的组成性或巨噬细胞表达破坏了铁调节蛋白的水平，并导致铁超载。PIEZO1是巨噬细胞吞噬活性和随后红细胞周转的关键调节因子。还发现E756del是存在于三分之一的非洲人后裔中的轻度GOF PIEZO1等位基因，与血浆铁的增加密切相关。该研究将巨噬细胞机制传导与铁代谢联系起来，并确定了非裔美国人铁水平升高的遗传危险因素。有研究在遗传性干瘪红细胞增多症中观察到铁过量的现象。在本研究中，作者首先检测了携带GOF Piezo1小鼠是否也会出现年龄起作用的铁超载。铁超载的一个特征是肝脏中存在过量的铁。作者用普鲁士蓝对肝脏进行了组织学分析，以检测铁：
1. 杂合子GOF Piezo1衰老小鼠(1岁以上)肝细胞铁染色，肝枯否细胞(巨噬细胞)中的铁染色更高，野生型未见染色(图1A)2. 纯合子GOF Piezo1小鼠铁沉积较杂合子更为严重(图1A)
1. 发现老化野生型小鼠的肝脏铁含量极低；老化的GOF Piezo1小鼠有升高的水平(图1B)2. 与组织学分析相一致的是，纯合子肝脏的铁含量明显高于杂合子(图1B)3. 杂合子或纯合子的成年成年GOF Piezo1小鼠(2-5月龄)与野生型对照相比并没有显示出肝脏铁含量的增加(图1B)除肝脏铁储存过多外，铁超载还与血清铁水平升高有关。作者测定了衰老小鼠和年轻成年小鼠血清铁的浓度：
1. 老化的GOF Piezo1小鼠血清铁浓度明显高于野生型对照组，纯合子的影响比杂合子严重(图1C)2. 与肝脏铁的积累相似，年轻的GOF Piezo1小鼠没有出现血清铁的升高(图1C)转铁蛋白饱和度是将血清铁含量除以可用转铁蛋白的总铁结合能力，反映转铁蛋白与血清铁结合的程度，并与血清铁水平有关：衰老的GOF Piezo1小鼠有显著的转铁蛋白饱和值(图1d)
血液中铁蛋白的浓度反映了体内储存的铁的数量，再加上转铁蛋白的饱和度，作为铁超载的临时测试：只有老化的GOF Piezo1小鼠才显着地提高了铁蛋白水平(图1E)因此，作者从肝脏铁积累、血清铁水平、转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度等综合证据表明，GOF Piezo1小鼠完全再现了罕见的遗传性干瘪红细胞增多症患者所观察到的年龄性铁超载表型，此转基因模型为进一步研究Piezo1对铁代谢的贡献提供了一个有用的工具。接下来作者试图阐明GOF Piezo1表达导致铁超载的细胞类型。血铁水平受红细胞、巨噬细胞和肝细胞相互作用的控制。Piezo1在小鼠肝细胞中不高表达，但在红细胞和巨噬细胞中呈阳性表达；因此，作者检测了这两种细胞类型对GOF Piezo1的需求。最初怀疑GOF Piezo1小鼠体内观察到的铁超载表型是红细胞脱水造成的。为了验证这一点，分析了仅在红细胞中表达GOF Piezo1的小鼠，却发现老化杂合子红细胞特异性的GOF Piezo1小鼠并没有在肝脏中积累明显的铁沉积(图2A)，老化杂合子和纯合子红细胞特异性GOFPiezo1小鼠的肝脏铁水平与野生型对照相似(图2B)；血清铁水平、转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度在老化红细胞特异性GOF Piezo1小鼠中都是正常的(图2C-2E)。肝脏和血清铁的证据表明红细胞脱水不太可能是遗传性干瘪红细胞增多症动物模型晚发铁超载的主要原因。作者使用LysM-Cre技术检测小鼠巨噬细胞中GOF Piezo1的表达：1. 观察到衰老的巨噬细胞特异性的GOF Piezo1小鼠肝脏(包括肝细胞和Kupffer细胞)铁沉积增加，纯合子比杂合子更明显(图2A)
2. 定量分析表明，衰老巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠肝脏铁含量与组成型GOF Piezo1小鼠的杂合子和纯合子没有区别(图1B和2B)
3. 衰老的巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠血清铁水平、转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度均高于野生型对照组(图2C-2E)4. 重要的是，巨噬细胞特异性Piezo1小鼠的这些血清铁测定结果与构成性表达GOF Piezo1的小鼠所观察到的值相当(比较图2C-2E和图1C-1E)
作者还检测过Piezo1过度活动的巨噬细胞是否通过红细胞异常间接导致铁紊乱：全血计数分析显示巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠红细胞数、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和体积(MCV)均正常。因此，巨噬细胞中的GOF Piezo1不太可能引起红细胞损伤，GOF Piezo1诱导的铁超载是由于其在巨噬细胞中的作用，而不是在红细胞中的作用。小肽激素庚类化合物是哺乳动物铁代谢的关键调节因子。肝细胞分泌的铁调素蛋白抑制铁向血液中的释放，并长期降低铁调素水平，导致铁超载。1. 发现在衰老的巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠肝脏提取物中的铁调素转录水平显著降低(图3A)2. 使用酶联免疫吸附法(图3B)测定衰老巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠血清铁调素蛋白浓度，明显低于野生型小鼠3. 年轻的巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠肝脏铁调素转录水平和血清铁调素蛋白浓度均有统计学意义的下降(图3C和3D)，尽管这一下降幅度小于在衰老小鼠中观察到的水平这些数据表明，衰老的GOF Piezo1小鼠发生铁超载之前，年轻的成年小鼠(正常铁水平)中的铁调素水平下降，提示铁调素通路的异常调控是遗传性干瘪红细胞增多症模型铁超载的关键诱因之一。年龄性铁超载可能是由于整个成年期持续的铁代谢失调所致。为了验证这种可能性，作者用急性铁应激对年轻的成年小鼠进行了实验。给成年小鼠腹腔注射右旋糖酐铁，剂量为40μg/g。1. 这种单剂量治疗不足以改变青年野生型小鼠24小时后血清铁含量、转铁蛋白饱和度或铁蛋白浓度(图4A-4C)2. 相反，所有测试的血液参数在杂合子组成的GOF Piezo1小鼠单次注射后均升高(图4A-4C)3. 巨噬细胞特异性的GOF Piezo1小鼠在铁胁迫下，血清铁水平、转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度明显升高(图4A-4C)这说明巨噬细胞中GOF Piezo1活性过高不仅会引起衰老小鼠铁超载，而且还会破坏年轻小鼠对铁过量的急性反应。接下来，我们检测了铁调素水平是否与观察到的急性铁调节失调有关：发现急性铁胁迫能显著提高成年野生型小鼠肝内铁调素转录本水平和血清铁调素蛋白浓度；然而，巨噬细胞特异性GOF Piezo1成年小鼠的铁调素转录和蛋白水平没有明显增加(图4D)。因此，急性铁应激实验表明，巨噬细胞中GOF Piezo1活性过高的小鼠在成年期由于铁调节功能的长期受损而导致铁超载。GOF Piezo1增强红细胞生成、周转和吞噬活性
巨噬细胞中过量的GOF Piezo1是如何影响铁调素水平的？铁调素在红细胞生成增加期间含量下调，以确保有足够的铁可用于新的血红蛋白合成。作者假设巨噬细胞中的GOF Piezo1能增加红细胞生成，从而抑制铁调素的产生。巨噬细胞特异性的GOF Piezo1小鼠的网织红细胞计数显著增加(图5A)，这是红细胞生成增强的指标。红血球是从骨髓和脾脏中产生的一种激素，在促红细胞生成素增强的过程中，它可以下调肝内肝细胞的表达。值得注意的是，与野生型小鼠几乎无法检测到的水平相比，成年巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠血清中的红细胞铁蛋白水平显著升高(图5B)。因此，Piezo1活性过高的巨噬细胞能促进红细胞生成，增加红细胞生成素的表达，从而降低铁调素的表达。高网织红细胞但正常成熟红细胞计数表明巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠红细胞周转率(即红细胞吞噬功能增强)长期增加。为了检测红细胞吞噬率，使用脉冲追踪实验测定了红细胞的半衰期，使用流式细胞仪测定标记红细胞的数量。在3周的时间里，成年野生型小鼠的荧光红细胞数量下降到初始水平的50%，巨噬细胞特异性的GOF Piezo1小鼠中标记的红细胞的下降速度明显快于野生型小鼠，并在3周结束时下降到几乎无法检测到的水平(图5C)；发现来自巨噬细胞特异性GOF Piezo1小鼠的脾巨噬细胞(F4/80+)所含的胞内红细胞(Ter119+)数量明显高于野生型(图5D和5E中的Q2)，说明GOF Piezo1的巨噬细胞在体内具有较高的红细胞吞噬活性；观察到了总TER-119+细胞(图5D中的Q2+Q3)的增加，因为脾脏是小鼠应激性红细胞生成的重要部位，而TER-119也被标记为红血球祖细胞。作者直接检测GOF Piezo1活性过高的巨噬细胞是否增强了吞噬活性。从野生型和巨噬细胞特异性的GOF Piezo1小鼠中培养出骨髓来源的巨噬细胞，并将其与荧光酵母多糖颗粒共同孵育，从而引发吞噬，并被巨噬细胞吞噬：发现GOF Piezo1巨噬细胞的荧光强度明显高于野生型巨噬细胞(图5F)，提示 Piezo1活性过高增强了一般吞噬过程。为了检测过度活动的 Piezo1是否能特异性地增加红细胞的吞噬功能(血细胞吞噬)，用定量的方法测定了受精卵化后的红细胞吞噬活：观察到GOF Piezo1可显著增加巨噬细胞吞噬红细胞抗原(图5G)；巨噬细胞中Piezo1活性过高会增加噬细胞功能(图5D和5E)。钙信号在吞噬过程中起重要作用。通过钙离子可以激活Piezo1，作者推测GOF Piezo1比野生型更能诱导巨噬细胞内钙内流。Rac1可被钙激活，并可以通过调节细胞骨架组织对吞噬细胞至关重要。作者用定量方法测定巨噬细胞吞噬过程中活化的Rac1：观察到当与照射后的红细胞共同培养时，GOF Piezo1巨噬细胞的活性Rac1水平显著升高(图5H)；在吞噬增强前，GOF Piezo1巨噬细胞中Rac1的激活增加(图5G和5H)。这些提示Rac 1活性的增加可能导致巨噬细胞吞噬功能的增加。在吞噬过程中，GOF Piezo1巨噬细胞中活性Rac1水平也有类似的升高(图5I)。因此，研究提供了巨噬细胞过度机械转导通过钙和Rac1激活影响吞噬功能的潜在机制。GOF Piezo1影响巨噬细胞的铁胁迫和吞噬功能
在巨噬细胞中过度活跃的GOF Piezo1可引起巨噬细胞吞噬功能的增加，并降低对急性铁胁迫的反应。然而，这些数据并不直接涉及内源性GOF Piezo1是否参与这些进程。为了评估GOF Piezo1在铁稳态中的体内需求，作者分析了巨噬细胞特异性功能丧失(LOF)Piezo1小鼠。1. 发现巨噬细胞的大部分机械激活电流依赖于 Piezo1，提示 Piezo1是这些细胞的主要机械传感器2. 评估了这些小鼠对短期铁胁迫的生理反应。将右旋糖酐铁注射到成年小鼠体内，每天剂量为80μg/g，连续5天，有效地提高了野生型小鼠血清铁水平、转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度(图6A-6C)。3. 巨噬细胞特异性的LOF Piezo1小鼠血清铁测定正常，与供药对照无明显差异(图6A-6C)。这表明Piezo1是巨噬细胞对短期铁胁迫的生理反应所必需的。接下来，作者检测了巨噬细胞特异性LOF Piezo1小鼠铁调素的表达：铁胁迫后成年巨噬细胞特异性LOF Piezo1小鼠肝脏和血清蛋白水平明显高于野生型小鼠。结合GOF Piezo1小鼠的研究结果，LOF Piezo1的数据表明这种机械激活的通道通过巨噬细胞依赖的机制控制铁调素的水平，从而调节铁的稳态；对GOF Piezo1小鼠的检测表明，该通道参与了巨噬细胞对红细胞的再循环和吞噬作用。为了测试这些过程是否需要 Piezo1，作者在体内对巨噬细胞特异性的LOF Piezo1小鼠进行了红细胞转换实验：发现巨噬细胞特异性的LOF Piezo1小鼠的红细胞明显低于野生型小鼠(图6D)，而GOF Piezo1小鼠的情况正好相反。最后，作者检测了 Piezo1对培养的BMDM巨噬细胞吞噬功能的需求：观察到，与野生型巨噬细胞相比，LOF Piezo1巨噬细胞内化的酵母多糖荧光明显减少(图6E和6F)，表明 Piezo1是有效吞噬的必要条件。在噬血细胞试验中检测到LOF Piezo1巨噬细胞内红细胞抗原的减少(图6G)，提示Piezo1是红细胞有效吞噬的必要条件；LOF Piezo1巨噬细胞中活性Rac1水平显著降低(图6H)，表明Piezo1通过Rac1激活调节噬细胞功能。这些LOF Piezo1数据表明，Piezo1是巨噬细胞吞噬功能和红细胞循环的重要调节因子。E756del GOF Piezo1与非洲裔美国人的高血清铁相关
作者之前的研究发现了在不同地理位置的非洲人后裔中有一个常见的轻度GOF Piezo1等位基因--E756del。估计有三分之一的西非裔人携带有 Piezo1的E756del突变。由于极强但罕见的GOF Piezo1突变导致欧洲血统遗传性干瘪红细胞增多症患者血清铁水平高，并导致铁超载。1. 发现40岁以下的E756del杂合子携带者与同龄非携带者相比，转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度没有显著差异；40岁以上的E756 del杂合子个体的转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度与同龄非携带者相比有统计学意义(图7A)2. 在杂合子E756del载体中，年龄与转铁蛋白饱和度/铁蛋白浓度呈明显正相关，而在非携带者中则无相关性，所有纯合子的血清铁参数都相对较高，且呈年龄依赖性(图7B)。在转基因小鼠模型中，发现铁调素下调是GOF Piezo1与铁超载之间的存在一种机制联系。在人类队列中，发现在40岁以上的E756del携带者中，与同年龄组的非携带者相比，血清铁调素蛋白浓度显著降低。1. 在人类队列中只有三分之一的人携带E756del，但大多数转铁蛋白饱和度或铁蛋白浓度较高的人携带有GOF Piezo1的E756del突变(图7C)2. 80%(16/20)的高转铁蛋白饱和度个体和82%(49/60)血清铁蛋白高水平的个体是E756del携带者；所有测量值都很高的个体(10/10)都是E756del携带者(图7D)。
该研究将巨噬细胞的机械传导与铁代谢联系起来，发现机械敏感的离子通道蛋白Piezo1的突变可造成血液中铁的过量。更重要的是，由一种严重但稀少的Piezo1突变出发，研究者通过小鼠模型和人群基因型的调查，发现E756del Piezo1在非洲血统人群中的高频率与普遍的铁含量升高现象相关，具有重要的临床意义。
作为2021年诺贝尔生理与医学奖获奖的研究发现--机械敏感的离子通道Piezo1蛋白，本研究论文提供了详尽的证据表明Piezo1具有调控铁代谢的重要功能。将铁代谢研究热点与Piezo1蛋白热点相结合，很值得各位小伙们好好了解一下。开拓出研究的新方向！
