压力异常和基线噪声,液相色谱这两大故障排查有办法了!

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液相色谱仪已经成为实验室一款常用仪器,使用仪器时最常见的故障就是遇到漏液和堵塞情况。上述两个问题在数值上通常都表现为压力的变化:漏液会引起系统压力的降低,而堵塞会引起系统压力的飙升。

而在液相色谱中另一个比较让人头疼的问题是基线噪音干扰,小编以这两个问题为例给大家分享下液相色谱故障的排查。

一、液相色谱压力异常

液相系统压力产生的原因在于流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压或系统压力。

漏液会引起系统压力的降低,而堵塞会引起系统压力的飙升。

系统压力的单位有:巴(Bar)、兆帕(Mpa)和磅/平方英寸(psi),它们之间的换算关系为1 Bar=0.1 Mpa=14.5 Psi。

1. 影响因素

影响系统压力的因素主要有流动相的溶剂组成、温度及流速这三方面:

(1)流动相的粘度是产生反压的主要原因,下图为有机溶剂-水的粘度随组成与压力的关系图:

由上图可以看到,乙腈-水比例为(20:80)、甲醇-水比例为(40:60至50:50)时,系统的压力最大。因此,在做实验时应尽量避开这个比例范围。另外,异丙醇粘度大,一般不作流动相使用。

(2)流速对反压的影响是线性关系,流速增加,反压亦增大。

(3)温度对反压的影响是反比关系,温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些。

(4)液相色谱仪各模块之间的连接管路也会产生压力,系统压力与管路的长度成正比,与管路直径的四次方成反比(1/D4)。上述考虑的是柱外因素对系统压力的影响,色谱柱对系统压力的影响也很大,反压与色谱柱长度成正比,与填料颗粒度的平方成反比(2.5μm填料比3.5μm填料反压高)。

2. 压力原因

具体到压力问题的表现形式上,主要有压力高、压力低或没有压力以及压力不稳:

(1)造成压力高问题的主要原因有:

①温度太低;

②流速太高;

③流动相粘度大;

④管路堵塞;

⑤仪器或色谱柱堵塞;

⑥压力传感器问题。

系统压力高的故障排除流程图如下:

(可点击图片放大查看)

(2)产生压力低情况的可能原因:

①系统内有渗漏处;

②单向阀堵塞;

③入口管路有气泡;

④溶剂滤头堵塞;

⑤所用溶剂不正确,储液瓶中无溶剂;

⑥温度太高,流速太低;

⑦泵未输送流动相;

⑧泵关闭或保险丝断了。

以上为仪器单向阀的结构示意图,如果某些原因造成宝石球与球基座发生黏结,造成液体不能进入到泵中,从而造成泵的压力偏低。

3. 造成压力波动可能的原因有:

(1)脱气机排气不充分;

(2)流动相未正确脱气;

(3)所用溶剂不混溶或易挥发;

(4)压力传感器及泵问题。

其中,大多数的压力波动都是由于气泡引起的(如下图):

二、基线噪音问题

1.基线噪音大

(1)流动相中有气体—溶剂脱气;

(2)流动池中有气泡—在出口处使用0.009的管路;

(3)色谱柱上的污染物被洗脱-平衡系统,直至基线稳定;如样品中有保留非常强的组分,可设置强洗脱程序;

(4)渗漏-此时应修复渗漏,重新连接或更换接头;

(5)检测器灯能量低-更换灯;

(6)灵敏度太高—使用合适的采样频率,调节增益(如ELSD检测器);

(7)检测器流动池脏—清洁流动池;

(8) 电噪音-除去电噪音的来源:屏蔽电缆,清洁触点;

(9)采样频率设置过大—味追求高采样频率,可能对灵敏度没有任何帮助,同时也会产生比较大的噪音:UV检测器推荐降低采样频率,HPLC推荐1-5HZ,UPLC推荐20HZ。

2.同步的基线噪音

(1)大多数情况下都是泵引起的,泵头中存在空气—将溶剂脱气,并重新灌注泵;

(2)单向阀问题—超声清洗单向阀或更换;

(3)柱塞杆断裂—更换;

(4)混合问题—更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积;

(5)电噪音—改变电路,除去来源。

3.不同步的基线噪音

(1)气泡—流动相要脱气;

(2)检测器中有气泡/空气—流动相脱气,或在检测器的后面加反压(不适用于RI检测器) ;

(3)渗漏—特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏,会造成流速的变化和混合比例的变化,从而导致基线噪音,此时应修复渗漏,重新连接或更换接头;

(4)管路堵塞—除去堵塞,冲洗系统;

(5)电噪音—除去来源,改变电路。

4.基线漂移:上漂或者下漂

(1)梯度变化引起,如溶剂B的吸收值高于溶剂A—使用基线差减,或尝试新的流动相;

(2)化合物从色谱柱上洗脱—平衡系统,直至基线稳定;如样品中有保留非常强的组分,可设置强洗脱程序;

(3)溶剂改变(气体吸附,蒸发)—氦气脱气,隔离溶剂;

(4)溶剂渗漏—拧紧或者更换接头;

(5)检测器温度影响(尤其是示差,电化学以及电导检测器)—流动池温度调节;

(6)柱温波动—等待柱温平稳,使用柱预加热器;

(7)压力变化—过滤溶剂以及样品,或样品太粘稠;

(8)混合问题—更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积。

5.Cyclic基线

(1)温度影响—隔离热源,或搬离临近的通风口,或增加流动池温度;

(2)混合问题—更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积;

(3)流动相中的气体—溶剂脱气;

(4)泵不稳定—检查维修泵;

(5)管路堵塞—冲洗系统,排除并除去堵塞源头;

(6)电问题—改变电路,或除去根源。

6.基线上的毛刺

(1)气泡—溶剂脱气,并重新灌注泵,流动相脱气越好,基线就会越好;

(2)信号连接不好,连线变松—清洁并拧紧检测器上的导线,或检查连线是否有损坏,或更换铲形接线片;

(3)灯继电器试图点燃熄灭的灯—更换灯;

(4)电噪音—更换电路,或除去根源。

7.小结

(1)确保无电源及电噪音干扰;

(2)为避免基线噪音,确保仪器系统内无气泡或空气,流动相首选过滤脱气;排尽管路、进样器、检测池中的气泡;选择合适的接头和管路,防止渗漏;

(3)在编辑方法时,针对HPLC和UPLC仪器UV检测器设置合适的采样频率,HPLC推荐1-5HZ,UPLC推荐20HZ;

(4)保持良好的操作习惯,如UPLC仪器水相流动相每天更换,添加了缓冲盐的流动相过0.2μm溶剂过滤膜等,都会减小基线噪音的产生。

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