突显网络（Salience Network ，SN）在包括药物滥用（Substance Use Disorder，SUD）在内的等神经异常疾病中常呈现工作异常。尽管突显网络最早是在人的研究中被发现，但是基于啮齿类动物的突显网络研究可以摆脱伦理审查的限制，在临床上探究其作用机制。本文使用32只大鼠的静息态功能核磁影像数据按照模块化分析的方法基于其功能连接矩阵按照连接模式将岛叶划分为多个功能亚区。随后我们使用基于追踪的方式以艾伦脑图谱为蓝本，验证了上述划分的结构连接基础。随后我们比较了在大鼠，狨猴以及人类中突显网络的连接情况。最后我们通过大鼠的海洛因戒断反应实验评估了突显网络在面对条件刺激下的突显网络响应。 依据腹侧前岛叶的功能连接模式，确定了原处于假设中的大鼠突显网络，该网络主要包括腹侧前岛叶（Ventral Anterior Insula，vAI）以及前扣带回皮层（Anterior Cingulate Cortex ，ACC）。通过荧光细胞的追踪分析确定了功能连接的结构基础。此外，我们发现了大鼠突显网络的解剖结构与人类以及其他非人灵长类动物具有一定的相似性。最后说明了大鼠突显网络对条件刺激的响应模式，同时发现在面对海洛因戒断时，其默认网络内部连接出现了增强。针对大鼠突显网络的生物学发现及其功能相关性的证明为规范化的分析以及在神经疾病模型中探究突显网络功能意义提供了新的平台。本文发表在Biological Psychiatry杂志。思影曾做过多期动物脑影像相关文章解读，欢迎结合阅览，增进理解和启发（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料）：
Trends in Neurosciences：扣带回皮质在哪里？
Biological Psychiatry: 童年的社会隔离对大鼠大脑功能连接性
Nature neuroscience：大脑连接在跨哺乳物种中的保留
钙光纤记录与fMRI技术结合
正文：
不同脑区以及回路之间的相互连接以及相互作用构成了复杂的大脑网络。而这些网络之中，在人类静息功能影像中发现的突显网络（Salience Network ，SN）与多种神经性异常疾病都存在一定的联系。突显网络在结构上主要由前岛叶（Anterior Insula，AI）、前扣带皮层（Anterior Cingulate Cortex ，ACC）以及腹侧纹状体（Ventral Striatum，VS）在内的区域构成。前岛叶作为凸显网络的中心节点，它将来自内外部的刺激进行整合与处理以引导适当的行为。在心理学上突显网络参与认知、运动以及情感加工，而也有学者认为突显网络实现了默认网络与执行控制网络之间信息的动态分配，使得个体可以稳态进行相关刺激的加工操作。长期的研究也发现包括由药物滥用在内的多种精神疾病，都观察到了突显网络中断以及与其他如默认网络（DMN）等网络的连接失调。尽管突显网络（SN）如此重要，但是它的结构与作用只在人类上有过详细研究。而在临床上的突显网络的分析可提高我们对其作用机理与病例学的理解。这里我们主要解决了2个主要的问题：1）我们确定了在大鼠中确实有与人类相似的突显网络的结构与功能模块。2）确定了大鼠突显网络对条件刺激的响应模式。为解决第一个问题。我们使用了大鼠的静息态功能影像数据用数据驱动的模块化分析方法来确定突显网络。随后我们通过评估大鼠突显网络的功能连接状态以及基于追踪的结构连接确定了包含在大鼠突显网络内的部分脑区，其功能与结构形式与人类的突显网络是否具有相似性。后面我们还在大鼠、非人灵长类动物以及人类中对这种网络的空间分布进行了相似性分析。最后我们介绍了在对有海洛因用药史的大鼠施加刺激时，突显网络表现出在其内部以及它和默认网络之间连接的变化，由此探讨了该网络作为突显网络测量因子的功能含义。总之，我们提供了一种全新的用于理解突显网络在健康以及病理学条件下作用的迁移平台。
方法与材料说明：
实验动物说明：
本次试验中共有两组大鼠用于突显网络的识别及其功能影响。所有的大鼠两到三只一笼进行标准化的饲养。
用于突显网络分析的大鼠共32只，品种为SD大鼠（SD大鼠为大鼠（rat；rattus norregicus）的一个品系，1925年，美国斯泼累格·多雷（Sprague Dawley）农场用Wistar大鼠培育而成，广泛用于药理、病理及生物学研究中），体重在350克左右的，采集其结构像和静息态磁共振影像数据。我们研究了最近发布的吸食海洛因大鼠在施加条件刺激下的任务态功能核磁影像数据。这批数据采集自21只体重在250到275克之间的雄性Long-Evan大鼠，提供海洛因供其吸食以养成药物依赖，部分以每天12小时使用海洛英（long access ,LgA），部分每天用药1小时（short access ，ShA）。在进行fMRI扫描之前，我们会将大鼠暴露于与盐水或纳洛酮（120 mg / kg）注射配对的条件刺激下。进行8次重复训练。其中纳洛酮条件刺激的提示会促使大鼠激发寻找和摄取海洛因的渴望。纳洛酮作为一种竞争性的阿片类受体拮抗剂，当对大鼠使用这类药物时，会产生与海洛因戒断有关的如厌恶感这类的动机相关信号，而不会产生海洛因戒断的体征。数据的采集在使用气味刺激24小时后进行。
数据的采集与获取
实验过程中，我们使用麻醉技术让实验大鼠的心率维持在65次/分钟，以保证在神经尺度上的耦合以及足够的对如气味等外部刺激的响应时间。在采集期间，大鼠头部会被牢牢固定以减少头动，并插入鼻管输入異氟醚（常见麻醉剂）进行麻醉。并在采集期间对其生命体征作严密的监控。影像采集使用布鲁克的9.4t动物核磁扫描仪。 第一组的数据采集：在采集了高分辨率T2加权结构像之后，又采集了三次高分辨率的功能像数据。 第二组的数据采集：在结构像数据采集之后，作block设计的任务态数据采集，设计上为440秒的静息加上四个40秒的on block气味条件刺激，再跟上80秒的off block,以此为一个循环，重复实验。
基于种子点的全脑功能连接分析：
所有影像数据的预处理都按照标准的处理流程进行。种子点的选择基于对岛叶模块分析得到的局部区域，或者在感兴趣的脑结构中确定ROI。为了解岛叶网络的空间分布模式，我们在回归了岛叶亚区的信号后，用皮尔逊相关分析，计算种子点到全脑的功能连接，并作fisher-Z变换，使得数据分布更加正态。组水平的显著性阈值使用随机的置换检验来计算团块阈值，以控制全局的假阳率，降低假阳性。
A岛叶模块化分析的网络矩阵。B矢状位视角的岛叶的三个模块化划分。C三个模块在冠状位界面视角基于模块化连边分析，我们确定了8个与腹侧AI有显著连接的roi。我们计算了8个roi之间的功能连接，并作zscore变换，组水平的平均功能连接限制显著性水平在0.001，并作多重比较矫正，保留强连边。结构连接性（SC）是从艾伦大鼠脑图谱进行的203次映射实验获得的。 映射密度计算为映射次数除以ROI体积。我们发现ROI的功能连接性与ROI之间的映射密度是相关的。
在海洛因戒断反应下突显网络连接分析
我们选定了腹侧前岛叶（vAI）、ACC以及后压部皮质（ RetroSplenial Cortex，RSC）等三个ROI来说明突显网络的连接关系。其中vAI来自于对岛叶模块化分析识别出的区域，而ACC与RSC则来自大鼠脑结构图谱。我们计算了ROI在不同条件下的皮尔逊相关，并作zscore进行标准化。在正负条件之间的差异可作为突显网络的一种指标。统计分析上我们作了混合方差分析,比较了不同分组、不同实验条件下突显网络对于这种基于海洛因条件刺激的响应情况。更进一步的，我们按照条件刺激呈现的时间差异做了更加细致的划分，最早的两个单元作为早期，最后的两个单元作为晚期。我们通过重复测量方差分析，比较了突显网络内部与突显网络和默认网络在任务之间的连接的差异。接下来，我们计算了纳洛酮刺激期间的SN内部连接变化和SN-DMN连接变化指数与纳洛酮条件刺激下的海洛因给药量之间的相关性。
实验结果：
大鼠突显网络的识别
因为在人中经典的突显网络是由前岛页的节点来定义的。首先我们要通过对大鼠内在网络模式的分析来确定其是否具有与人类突显网络类似的脑网络网络构成。通过岛叶的静息态连接分析，我们将其功能网络划分为三个模块：背侧前岛叶（dorsal Anterior Insula ,dAI），腹侧前岛叶(ventral Anterior Insula ，vAI)以及后岛叶（posterior insula，PI）。以上述模块化分析得到的三个岛叶亚区为种子点，我们计算其到全脑的功能连接。比较不同任务下的功能连接情况，我们发现vAI为种子点的功能连接差异主要在（ventral/dorsal agranular insular cortex (AIV/AID)背侧岛叶皮层和腹侧岛叶皮层，腹外侧眶额皮层（ ventral/lateral orbital cortex,）、边缘前皮层（prelimbic cortex），边缘下皮层和初级/次级扣带皮层(Cg1/Cg2)（primary/secondary cingulate cortex (Cg1/Cg2)）组成。相比之下，dAI的连通区域主要由AID、后岛叶皮层(AIP)（posterior insular cortex）、非颗粒状/颗粒状岛叶皮层（dysgranular/granular insular cortex）、感觉皮层和额叶皮层的3区（sensory cortex, area 3 of the frontal cortex ）组成。最后，后岛页的主要连接区域由AIP、感觉运动皮层、视觉/听觉皮层和顶叶皮层组成。值得注意的是，只有基于vAI模块种子的连通区域包括AI(前岛叶)和ACC(前扣带皮层) (Cg1和Cg2)，它们被认为是人类SN网络中的主要枢纽。
Figure 2 vAI功能连接显著脑区分布：1)腹侧眶皮层，2)外侧眶皮层，3)边缘前皮层，4)边缘下皮层，5)背侧岛状突起皮层，6)腹侧岛状突起皮层，7)初级扣带皮层，8)次级扣带皮层，并延伸至9)次级运动皮层。
Figure 3 dAI功能连接显著脑区分布：3)额叶区，11)粒状/粒状岛叶皮质，12)初级/次级感觉皮质，13)后粒状岛叶皮质。
Figure 4 PI功能连接显著脑区：12）初级/次级感觉皮层，13）后岛叶皮层，14）初级/次级运动皮层，以及15）顶叶、视觉和听觉皮层。
我们使用独立成分分析（ICA）这种数据驱动的分析方法对我们先前得到的源自模块化分析的网络连接模式进行验证，同时我们还基于细胞结构将岛叶划分为5个分区计算了对全脑的功能连接。随后我们使用差异化的分析策略，观察到大鼠的一种由岛状突起(AIV和AID)的前部和包括ACC在内的额叶皮质脑区构成的固有的脑网络结构。我们推测这就是存在于大鼠中的突显网络。
啮齿类动物的突显网络
脑区之间的结构连接是功能联系的物质基础，通过公开数据中的细胞追踪分析，我们证实了突显网络确有其结构基础。另外通过在vAI注射绿色荧光示踪剂的分析也验证了对ACC的预测分析。由解剖学上定义的8个ROI两两之间的连接关系由细胞追踪方法观察到的由一个脑区出发最终到达另一个脑区的投射密度来量化。功能连接则取ROI内所有体素的平均时间信号计算皮尔逊相关而来。发现功能连接与结构连接之间存在高度的相似性。对突显网络作聚类分析发现包括岛叶和前额叶两个稳定的脑区组合。而对应的脑区之间的结构连接与功能连接无论在团簇内或者团簇间都存在显著的相关性。总而言之，对突显网络作可视化分析也揭示功能连接与结构连接的相似性以及差异性。这就包括在前额叶内较强的功能连接以及ROI之间较强的结构连接。
在大鼠、非人灵长类动物以及人类中共有的突显网络研究
为确定突显网络跨物种的结构相似性，我们在大鼠、狨猴以及人类中接近岛叶结构区域设置了多个种子点以分析其网络结构。大鼠的突显网络主要包含前岛叶、acc以及眶额叶皮层，这与在小鼠上的发现是相似的。绒猴突显网络包括前岛页、ACC、内侧前额叶皮层、框部前额叶皮层和味觉皮层。而人类的突显网络包含了岛叶、腹侧ACC以及纹状体。因此我们得出结论：突显网络在生物进化中呈现出趋同进化的现象。
Figure 6不同物种之间突显网络的空间分布：A大鼠的突显网络，B猴子的突显网络，C人的突显网络如果您对动物和人的脑影像数据处理感兴趣，欢迎浏览思影科技课程及服务（可添加微信号siyingyxf或18983979082进行咨询）：
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突显网络对于戒断反应刺激的处理
为了验证大鼠的突显网络是否可以像人的突显网络一下对外部环境的突出刺激进行侦测和集成处理。我们分析了先前工作中获取的影像数据。这些大鼠会在提供气味诱导后供给纳洛酮以诱导大鼠的海洛因用药。大鼠会进行训练，以生理盐水或者纳洛酮为条件刺激养成其吸食毒品的条件反射。纳洛酮会诱发大鼠的消极情绪并促使其去搜索并吸食海洛因。
鉴于纳洛酮诱发气味线索的显著性(36)，我们假设大鼠SN中的连通性会随着纳洛酮配对条件刺激在LgA（long access ,LgA）中的呈现而变化，而ShA（short access ，ShA）大鼠不会。由于vAI与人类突显网络中的两个重要节点具有一定的相似性，所以我们用这些区域内的功能连接来衡量突显网络内部的连接性。突显网络内部连通性会随着诱发的气味信号而变化，其中对纳络酮的诱发最为敏感。我们会以有无气味诱导之间的网络连通性的对比指数来测试突显网络内部连通性是否会对纳络酮的参与产生明显的响应。我们探究了不同用药形式以及不同诱导方式的方差分析，发现主效应的显著性，且无论如何给药，大鼠对纳络酮的响应相对盐水都更加强烈。
C on -off期间SN内部链接变换的组间比较，D 不同组处理下下on -off期间SN内部连接变化的比较，考虑到在固定的时间间隔内反复接触感官刺激会产生习惯或者疲劳，我们探索了随着时间的推移对气味刺激的反应。我们把气味试验分为早期(前2次试验)和晚期(后2次试验)，并进行了2(海洛因获取)x 2(提示)x2(试次) 重复测量方差分析。我们发现在诱发方式上存在显著的分组效应（P=0.018），在诱导方式与试次之间有着显著的交互作用(P=0.023)。事后检验分析也发现有纳络酮诱发的突显网络内部的连接变化的差异也要显著高于盐水诱导的差异，在忽略分组时，最后的trial是有差异的(P=0.001)，但是开始的trial无差异(p=0.63)。我们评估了后期试验中SN的反应与对气味调节的行为反应之间的关系，这被认为是刺激突出性性的代表。在实验后期由于纳洛酮的刺激诱发了突显网络连结性变换的差异与纳络酮提示条件作用中注射海洛因的数量之间有较强的相关性，我们认为这是纳洛酮诱导戒断动机成分的一个指标。因此根据上述定义，纳洛酮作为条件刺激的海洛因供给越多，在扫描中纳洛酮刺激呈现时诱发的突显网络内部耦合越多。
突显网络与默认网络在海洛因戒断条件下的耦合分析
SN和DMN之间的耦合被认为是认知控制的关键，并与戒断期间用药者的戒断症状调节认知资源分配有关。我们测量了SN和DMN的节点之间的耦合，以确定增加的SN与DMN的连接是否与戒断有关。如果说前岛页和PCC分别是人类突显网络和默认网络的重要节点，那么vAI和RSC就分别是大鼠突显网络和默认网络的重要节点。在气味刺激呈现过程中，vAI和RSC之间的功能连接显示了其强度随时间的变化；在LgA大鼠中，纳洛酮刺激在后期的试验中呈现出SN-DMN耦合的增强。
D 不同时段下，不同组在不同诱发条件下网络间连接变化的差异，E 海洛因注入量与SN-DMN连接强度变化之间的关系为说明突显网络与默认网络之间的连接是否会随着纳洛酮的刺激出现变化，我们设计了突显网络与默认网络的耦合指数，用于反映突显网络与默认网络之间的连接在刺激有无时的变化。以海洛因的接触方式以及条件刺激方式为分析的因素作2*2方差分析，我们发现在接触方式上存在显著的主效应（p=0.05）。而LgA大鼠中则扩大了这种突显网络与默认网络连接的差异。为了在探究在时序上的差异，在原有的2*2分级的基础上增加对不同trial的差异分析，发现海洛因的接触方式仍有显著的主效应差异(p=0.024)，而在刺激方式以及时序上有显著的交互效应(p=0.042)。通过事后比较可以确定在实验后期，纳洛酮诱导引起的默认网络与突显网络的连接变化要大于盐水诱导的变化(p=0.012)。由于我们已经在人类中观察到突显网络与默认网络连接性的增强可以预测吸毒者的戒断行为，所以我们又检查了在最后的trial和戒断行为下突显网络与默认网络连接差异变化之间的关系。如突显网络内部连接的差异，戒断期间内突显网络与默认网络在纳洛酮刺激下的耦合差异与海洛因的注射量成正相关。
讨论：
本研究识别出了大鼠突显网络的主要成分，完整表述了其结构与功能上的组成，并论证了在突显刺激侦测的功能相关性。具体来说，我们确定在大鼠脑中有与人类大脑相似的由三个模块化亚区组成的脑叶结构。我们认为其中的vAI以及ACC组成的网络结构就是大鼠的突显网络。利用小鼠Allen脑图谱的解剖神经元示踪数据也证实了突显网络的结构连接基础。此外，被识别的大鼠突显网络的解剖结构与非人灵长类以及人类的解剖结构具有一定的相似性。最后，将海洛因视作一种环境的突显刺激，大鼠突显网络内部连接以及突显网络和默认网络的连接强度与海洛因戒断相关条件刺激的呈现有关。
脑叶对突显刺激的整合分析
脑岛叶可以根据功能与细胞结构特征划分为3个主要分区，这是跨物种的。我们对这些分区进行了总结，并研究了大鼠的vAI、dAI以及PI三个亚区之间的关系。与人类和非人灵长类的突显网络类似的，vAI会连接到包括眶额皮质、前额皮质以及ACC在内的额部皮质，这些区域涉及奖赏评估、工作记忆和行动选择或情感状态表征。此外，皮层下的纹状体、杏仁核和丘脑等区域的参与也被认为对SN的功能至关重要。尽管我们没有在FC测量中观察到vAI与皮层下核团的连接，但解剖示踪研究已确认vAI与额叶的连接，并确定杏仁核、丘脑与vAI之间映射，说明vAI可能在情感或自主加工中发挥作用。鉴于前岛页的药理学失活使大鼠的表现从高风险转移到了低风险或低奖赏状态，以及前岛页和额叶皮层之间的SC的中断，我们的发现表明前岛页在解剖学上和功能上都与额叶相关皮层并参与指导行为输出。vAI整合了来自dAI包括自主、情感和的刺激及味觉信号和来自PI的感觉信号在内的多种输入，并通过与额叶皮质的连接来指导行为。然而，由于缺乏与额叶区域的连接，导致负责处理味觉和自主控制的dAI并没有与人类相似的空间连接模式，这可能就反映了物种间连接模式的差异。后岛页在功能上连接到包括听觉和视觉皮层在内的多个感觉皮层，dAI也在功能上与运动皮层和感觉皮层产生连接，这与之前的电生理学研究和在人类中观察到的一致。因此，我们确定并证实了先前已知的沿大鼠脑岛突前后方向从认知/情感到体感的功能梯度。这些发现支持了AI(前岛叶)作为集成包括自主，情感和感觉刺激在内多种功能输入枢纽的作用。 vAI与ACC的FC强度在戒断相关的刺激过程中增加，支持了大鼠突显网络参与情感突显性信息处理。
突显网络在神经精神疾病中的作用
SN网络在认知、情感和动机维度等范围内被广泛激活，而SN功能障碍与包括SUD网络在内的许多神经性精神疾病有关。在SUD的网络模型中，岛叶被认为是一个重要的中枢，因为它在表现内在感受状态中扮演着重要的角色，而内在感受状态分别包括吸毒和戒断的快感体验和快感缺乏体验。岛叶的抑制或损害破坏了在啮齿动物和人类成瘾者中的药物述求，并且在随后复发的吸烟者中观察到了诱导下更大的的岛叶反应，表明了岛叶在药物成瘾中的关键作用。刺激诱发的岛叶激活与更大的岛叶-额叶连通性相关，而SN中条件刺激诱导的活动与个体对吸毒冲动的评级相关。我们之前的工作表明，在自给药海洛因期间，线索与纳洛酮一起显著激活了杏仁核、下丘脑和脑岛，这些区域涉及到戒断诱导的应激反应，以及激发大鼠寻求和吸食海洛因的动机。在这里，我们对这些数据使用了不同的分析策略，发现在海洛因戒断条件刺激呈现过程中，突显网络内部连接增加了。鉴于解剖示踪数据支持了杏仁核、下丘脑和脑岛之间的结构连接，我们推测杏仁核和下丘脑在刺激诱发的负面情绪处理中有所参与，并在戒断期间与脑岛沟通以进行突显性处理。这些由于岛叶明显的作用差异以及戒断反应下采集的数据导致了SUD，这些都与在大鼠尼古丁戒断反应研究中中所观察到的现象相一致。
海洛因戒断条件下的突显网络与默认网络连接的增强
包括SUD在内的多数神经精神疾病常伴随大规模网络的异常组织。在三元网络模型中，假设突显网络通过在控制网络和DMN网络之间进行认知资源的调配来控制环境信号的响应，由此促进行为的选择。在网络的分工上，执行控制网络负责面向外部的注意与执行活动，而DMN则负责内部方向性的确定。因此，SN-DMN的耦合可能对认知控制更加重要。急性尼古丁戒断会使吸烟者的SN-DMN偶联上升，从而增强DMN活性，而SN-DMN偶合的这种变化与更剧烈的戒断和对内部状态处理的差异相关。在这里，我们观察到在大鼠呈现海洛因戒断响应时，SN-DMN的偶合出现一致性的增强。情感戒断相关的刺激是一种非稳态和时间相关性的刺激，可能是由于SN-DMN耦合的增加而导致反省行为的增加。早期的实验中在不考虑气味条件刺激的关联时，我们观察到SN内部和SN - DMN之间的耦合增加。关键的是，在后期的试验中，只有与条件刺激诱导的戒断相关状态维持了与SN内部以及与SN-DMN之间耦合的增强。
结论：
利用多种成像序列、分析方法和解剖数据的确证，本文在啮齿动物中确定了一个假定的突显网络，并证明其基本解剖和功能连接主要是在前岛页和ACC之间，这与人类和非人灵长类动物的同源网络的组成一致。并进一步证明了该网络与线索诱导的条件性海洛因戒断有关的功能含义，其中SN响应了与情绪相关的条件性戒断相关线索增强了与DMN的交流。本文表明，脑岛和SN可能作为高度突出的环境刺激的指示物或生物标记，可以模拟海洛因戒断成对的条件刺激。作者认为，在动物模型中，SN的离散靶向可能有助于监测和评估干预措施，并可能作为人类的治疗靶点。更普遍地说，这些发现为进一步干预和了解这一重要的大规模网络的功能及其在神经精神疾病中的失调提供了一个新的迁移平台。如需原文请添加思影科技微信：siyingyxf或者18983979082获取,如对思影课程及服务感兴趣也可加此微信号咨询。觉得对您的研究有帮助，请给个转发，以及右下角点击一下在看，是对思影科技莫大的支持。
