如何控制基因毒性杂质？

01、何为基因毒性杂质

基因毒性杂质（或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity，GTI）是指能直接或间接损害DNA，引起DNA突变、染色体断裂、DNA重组及DNA复制过程中共价键结合或插入，导致基因突变或癌症的物质（如卤代烷烃、烷基磺酸酯类等）。潜在基因毒性杂质（Potential Genotoxic Impurity ，PGI）结构中含有与基因毒性杂质反应活性相似的基团（如肼类、环氧化合物、N-亚硝胺类等），通常也作为基因毒性杂质来评估。基因毒性杂质主要来源于原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物。此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能会降解产生基因毒性杂质。除此之外，有些药物通过激活正常细胞而产生基因毒性物质导致突变，如化疗药物顺铂等。

02、何为基因毒性杂质“警示结构”

由于杂质结构的多样性，一般很难进行归类，因此，在缺乏安全性数据支持的情况下，法规和指导原则采用“警示结构”用来区分普通杂质和基因毒性杂质。所谓“警示结构”，是指杂质中的特殊基团可能与遗传物质发生化学反应，诱导基因突变或者染色体断裂，因此具有潜在的致癌风险。对于含有警示结构的杂质，应当进行（Q）SAR预测和体内外遗传毒性和致癌性研究，或者将杂质水平控制在毒理学关注阈值（TTC）之下。但是含有警示结构并不能说明该杂质一定具有遗传毒性，而确认有遗传毒性的物质也不一定会产生致癌作用。杂质自身性质和结构特点会对其毒性产生抑制或调节作用。警示结构的重要性在于它提示了可能存在的遗传毒性和致癌性，为进一步的杂质安全性评价与控制指明方向。（关于基因毒杂质警示结构的详细信息可参考欧盟发布的警示结构《Development of structure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents》）。

03、基因毒性杂质严格控制的必要性

基因毒性杂质最主要的特点是在极低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，导致基因突变并促使肿瘤发生。因其毒性很强，对药物的安全性造成强烈的威胁。由于基因毒性杂质控制不合规，已造成上市药品强行被召回，给企业造成了巨大的损失。例如：奈非那韦（甲磺酸盐）是一种用于HIV治疗的抗病毒药物，分别于1997年和1998年由FDA和EMA批准后上市。2007年6月，罗氏制药接到6名患者投诉DNA序列异常后，立即召回产品，EMEA暂停其上市销售。在后期内部调查时发现原料药存储罐中有残留的乙醇未清除干净，与甲基磺酸反应形成甲磺酸乙酯。之后罗氏对存储罐这一步工艺进行修正并在生产过程中增加对甲磺酸乙酯的控制，要求低于0.5ppm。EMA重新评估检查后，2007年10月才恢复其上市销售。因此，在该事件后，各国的法规机构ICH、FDA、EMEA等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的药企在新药研发过程中也重点关注基因毒性杂质的控制和检测。

04、常见GTI/PGI

图1. 常见GTI/PGI种类

磺酸酯

如合成工艺中使用了磺酸类试剂（如：对-甲苯磺酸、甲磺酸）和低级醇（甲醇、乙醇等），则有可能形成磺酸酯化合物，根据取代基的不同，磺酸酯可分为烷基磺酸酯和芳基磺酸酯。这些物质能与DNA 发生烷基化反应，从而可能成为引发癌症的诱因，尤其是甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯及甲磺酸异丙酯已被证明具有基因毒性，同时其它磺酸酯类也存在潜在基因毒性。

卤代烷烃

卤代烷是在药物合成过程中经常使用到的烷基化试剂，含有一个或者多个卤原子的化合物，结构种类繁多，可以分为氟代烷、氯代烷、溴代烷和碘代烷，是基因毒性杂质中最为常见的一类。卤代烷烃的反应活性较强，能直接与生物大分子，如DNA、RNA及蛋白质发生烷基化反应，从而导DNA的突变。

酰卤

酰卤类化合物中以酰氯最为常用，是化学合成中重要的酰化试剂。尽管尚无明确的数据证明酰卤类化合物具有基因毒性和致癌性，但是这类化合物含有警示结构基团，是潜在基因毒性杂质，在药物中需要严格的分析与监测。

肼

肼类化合物是已知的基因毒性杂质，具有潜在的致癌性。该类化合物性质活泼，主要通过代谢活化生成碳正离子和碳氧自由基等活性较强的中间体，这些中间体能够与DNA发生烷基化反应或者导致DNA的其他病变。

叠氮

叠氮类化合物也是常见的基因毒杂质之一，该类化合物能够抑制细胞色素氧化酶及多种酶的活性，并导致磷酸化及细胞呼吸的异常。叠氮类化合物的主要急性毒作用是能够引起血管张力极度降低，因此要严格控制。

05、基因毒性杂质基本控制思路

国外制药企业为了产品的成功上市，减少基因毒性杂质相关风险，对于基因毒性杂质的控制基本形成了以下思路：

a. 对工艺路线中所涉及的基因毒性杂质来源进行评估，分析其合成路线，全面考虑起始物质、试剂、溶剂等可能带入的基因毒性物质；

b. 对评估出来的杂质根据是否存在致癌性或者是否存在警示结构进行分类；

c. 确认临床试验中短期用药的每日允许摄入量；

d. 根据杂质类型分类，论证药物基因毒性杂质残留限度，设定严谨或合理的阈值，并使用可靠的分析手段对基因毒性杂质进行针对性的分析检测。

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