Crispr/Cas9原理实及实验流程笔记
背景
Crispr/Cas9在微生物中起到的作用就是识别入侵、将病毒的DNA录入自己的基因组，当病毒再次入侵时候，切割病毒DNA、RNA进而消除病毒的感染。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个细菌免疫系统，细菌地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。
原理
结构
Crispr在编辑基因的时候，需要2个成分①Cas9核酸酶；②gRNA（全称是guide RNA，引导RNA）（需要设计里面的部分序列）。
Cas9
其中Cas9核酸酶的基因已经被整合到商业化载体中，因此使用者只要自行设计sgRNA，然后构建Cas9/sgRNA表达载体，转染细胞，就可以行使基因组的定点基因编辑任务。
sgRNA结构
gRNA（guided RNA）是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，由两部分组成，分别是tracRNA和crRNA。其中crRNA引导cas9定位到要编辑的DNA序列附近，它有一段序列与tracrRNA的一部分是同源的，因此这两者可以部分结合。
tracrRNA的作用在于：形成一个茎环结构，与Cas9蛋白结合，示意图如下所示：
将上图的细节放大（图片来源于Sigma），如下所示：
如何发挥作用
Cas9和gRNA会形成一个Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。这个RNP就能结合到基因组上的靶序列上。而基因组上的靶序列如果要被切割，需要满足两个条件： 第一，gRNA与基因组上有17-21个碱基的同源区，也被称为protospace。 第二，靶序列附近有PAM（protospacer adjacent motif），需要注意的是，在设计gRNA时，PAM并不是gRNA的一部分，找公司合成的gRNA时，里面是没有PAM序列的。
作用示意图如下所示：
在tracrRNA引导下，gRNA与基因组上的靶序列结合，进而RNP切割靶序列，形成一个DSB。
下图是Takara官网的原理示意图：
阶段 1：外源 DNA 采集
外源核苷酸是通过Cas 蛋白识别，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿 主CRISPR 位点中，由重复序列隔开。对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵 DNA 中两侧出现2-5 个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。一般 protospacers 连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及 Cas1、Cas2 和 游离3’-hydroxyls 等元件的机制，牵引序列。Protospacer 的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。如下所示：
阶段 2：crRNA 合成
CRISPR RNA 在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的 CRISPR衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs 每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。
阶段 3：靶向干扰
在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活tracrRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。
补充：cas9解螺旋的过程
Cas9可以解开DNA，gRNA和target dsDNA配对是在解旋之后所进行（文献为：Sternberg, S. H., et al. (2014). “DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.” Nature 507(7490): 62-67.）。步骤如下：
gRNA和Cas9形成Cas9:gRNA complex.
这个complex来寻找双链DNA上的PAM位点。因为crisper/cas9源于细菌的防御机制，为了定点清除进入细胞内的“异己DNA而设计”，PAM就是evolutionary conserved关于“异己DNA”的特异标志，所以Cas9需要识别PAM也就不难解释了。现在分子生物学常用的Cas9源自S. Pyogenes这个细菌种属，这种Cas9的特异PAM是5’ NGG(N可以是任何nucleotide)。在人类基因组上GG占5%（每42bp就有一个），因此人的绝大多数基因都在PAM附近，也就意味着几乎所有人的基因都可以被Cas9识别。
当Cas9:gRNA complex识别到PAM的时候，Cas9就会把下游的双链DNA解旋，然后这个complex来根据gRNA的序列“扫描”解旋的DNA，一旦发现和gRNA序列互补的DNA，Cas9就会把DNA切开，完成操作。
下图是Doudna那篇paper的原理解释的figure
sgRNA的序列特征和设计
sgRNA的序列设计原理
gRNA 设计靶序列选择：在NCBI找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子。可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果被敲除的靶标基因是microRNA或者lncRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
gRNA设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到PAM序列：NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt即可 （如下图所示）。
从前面的原理中可以知道，这个gDNA是与基因组上的正义链是相同的。
目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全敲除一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas系统诱导产生indel）。
注：indel全称为insertion，deletion，即插入，缺失，缩写为indel， 插入如下： 生物原始基因序列：ATCGTCGAATCCGGTTG 发生突变基因序列：ATCGTCGAAatcgTCCGGTTG，其中的小写字母atcg为插入的序列，为插入突变；
缺失： 生物原始基因序列：ATCGTCGAAtccgGTTG 发生突变基因序列：ATCGTCGAAGTTG，其中，原始序列里的小写字母tccg为缺失的序列，为缺失突变； 插入和缺失都相对于原始序列来说：缺失指，在原始序列中的某一段丢失；插入指，相对于原始序列在某个位置多了一段序列，即在这个位置插入了一段序列
因此我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外，通常一个基因往往会转录成2个以上的转录本，所以请选择尽量靠近5’端的公共部分，保证每个转录本都会成功移码突变。
通常情况下，为了便于下游KO mutants的鉴定，我们往往可以作如下设计：即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp内酶切位点唯一（下游的敲除突变也能通过测序的手段来鉴定）。
上图的酶切示意图就显示了，敲除突变无法被酶切，而野生型的则能够进行酶切。
不过现在已经有了很多在线的gRNA设计工具，现在就以其中的一个为例说明一下。
sgRNA的载体连接
现在已经有很多可以设计gRNA的工具，这里直接略过，直接看后文中所附的gRNA设计工具即可。
我们实验室自己使用的是U6-sgRNA-SFFV-spCas9-PURO，示意图如下所示：
使用的酶切位点是BbsI，使用BbsI切开后的切口如下所示：
因此，在合成gRNA的两条链时，正义链上的oligo序列前面要加一个cacc，而负义链上的oligo序列前面要加上aaac。
例如我们最终确确定的gRNA序列为CTGTTTGTGCAGGGCTCCGA，它要在两边加上caccG，这个cacc与BsmBI酶切后的gtgg配对，加G是因为这个转录起始位点，必须要加上，如果本身第一个是G，则不需要添加，另一条是5’-TCGGAGCCCTGCACAAACAG-3’，它的两端要加上aaac与gttt配对。
那么最终需要合成的序列有2条：oligo1：5’-caccGCTGTTTGTGCAGGGCTCCGA -3’； oligo2：5’- aaacTCGGAGCCCTGCACAAACAGc-3’。加粗部分与经BbsI酶切后的载体互补配对，BbsI的酶切位点如下所示：
BbsI酶的信息如下所示：
全称：BbsI-HF
货号：R3539
保存条件：负20度
缓冲液：CutSmart Buffer（NEB带有HF（即High Fidelity）字样的酶都支持CutSmart）
cas9基因编辑案例分析
这个案例来源于Takara官网案例。
目标序列DNA的3'末端必须要有一个PAM（proto-spacer adjacent motif）序列，此序列为5'-NGG-3'。PAM序列上游的20个核苷酸就是我们要编辑的靶序列（也就是crRNA），Cas9核酸靶将会切除PAM上游的约3个核苷酸。
这里需要注意几点：
第一：寻找靶序列中的PAM序列，也就是NGG，我们需要注意的是，PAM序列并不是gRNA的一部分，因此在合成gRNA时，里面是没有PAM序列的；
第二：RNP在切割靶序列时，是可以切割任意一条链的DNA的（可能是正义链，也可能是反义链，总之在做敲除时，最终目的就是破坏DFNA）。
上图的流程是分三步：
确定靶序列的PAM序列，如上图中红色方框所示部分，是TGG；
在PAM上游数20个核苷酸；
合成gRNA（这个gRNA就是TGG前面的20个核苷酸序列）。
文献案例
再来看一个文献中的案例：
文献信息如下所示：
1 |
Chang, N., et al. (2013). "Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos." Cell Res 23(4): 465-472. |
文献中是使用了cas9编辑了斑马鱼的etsrp基因，文献中的示意图如下所示：
红色方框画的就是靶序列，在Ensembl数据库中检索斑马鱼的etsrp外显子2序列，如下所示：
1 |
ATATGGAAATGTACCAATCTGGATTTTACACAGAAGACTTCAGAACTCAGGAGGTTCCTGCTGGTTTCGACTTCAGTTCATATG |
导入Snapgene，标记出来gRNA序列，如下所示：
从上图可以看到，这个gRNA序列就是位于正义链上。
实验流程
载体构建流程
1. Oligo退火形成duplex
| Component | Volume |
|---|---|
| oligo1 | 1ul(100uM) |
| oligo2 | 1uL(100uM) |
| H2O | 8uL |
| total | 10uL |
PCR仪 95℃ 5 min，缓慢降温至室温1h，1：200稀释duplex。
2. 质粒酶切
| Component | Volume |
|---|---|
| lentiCRISPR plasmid | 2ug |
| BbsI-HF（不同的质粒有不同的酶切位点） | 1uL |
| 10X buffer | 2uL |
| H2O | X uL |
| total | 10 uL |
加入以上成分，于37摄氏度酶切15分钟（不同的酶有不同的酶切时间，这个要看说明书）。此处使用的Cas9载体的gRNA插入位点如下所示：
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3. 胶回收 大片段约11kb 回收，回收后的线性片段要放到负80度冰箱，因为BbsI这个酶消化后的质粒（我自己用的质粒）有一端是AAA，容易降解（如果没有，则放负20度即可）。
4. 连接
| Component | Volume |
|---|---|
| T4 DNA ligase(TaKaRa,2011A) | 1uL |
| 10 X DNA ligase buffer | 1uL |
| digested lentiCRISPR plasmid | 2uL |
| duplex | 6 uL |
| total | 10 uL |
室温连接4-6h，随后转化，转化时要把所有的连接体系加入到感受态中，因为载体的连接效率不高。
病毒包装体系
| Component | Volume |
|---|---|
| lentiCRISPR v2-gDNA plasmid | 4ug |
| psPAX2 packaging plasmid | 3ug |
| pMD2.G envelope plasmid | 1ug |
如果是使用Lipo3000进行病毒包括，则整个包括体系如下所示：
| 溶液1 | 溶液2 |
|---|---|
| ① OPTI-MEM 121.25μL | ① psPAX2(1.5μg= X μL)(X) |
| ② lipo3000 3.75μL(或7.5，第一次需要摸索条件) | ② pMD2G(1μg= YμL)(Y) |
| ③ 目的质粒(2.5μg= Z μL)(Z) | |
| ④ OPTI-MEM (125μL-X-Y-Z-10= μL) | |
| ⑤ P3000TM试剂 10μL(最后加) |
注：注：（1）包装质粒PAX2 ：pMDG2：和目的基因质粒=3:2:5，因此前期工作，每种质粒的浓度最好为：[1]psPAX2（500ng/μL）[2]pMD2G（500ng/μL）[3]目的质粒（500ng/μL）
（2）Lip3000（μL）∶DNA（μg）的推荐比例为2.5∶1
转染
转染条件与常规的病毒转染相同。
转染48h后，加入puromycin来筛选细胞，1mL的培养基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是说嘌呤霉素的终浓度是5μg/mL。
测序
加了嘌呤霉素的培养基要每天更换，每次里面都要含有5μg/mL的嘌呤霉素，这个时间要持续7天。在第7天的时候，取一定数量的细胞，提取DNA，测序，这一步的目的主要在于，确定是否存在有基因敲除的细胞，如果没有，就要重新包病毒进行敲除。
如果存在基因敲除的细胞，那么gRNA切割位点处就会产生套峰，表示有效编辑的效应为50%，如下所示：
单克隆的获取
当测序结果出现套峰时，表明这批细胞中存在被敲除的细胞，此时就可以分离单克隆了，分离单克隆主要有下面的几种方法。
有限稀释法
有有限稀释法的过程为：收集细胞，计数，将细胞的密度稀释为500个/mL，此时，用20μL移液枪吸取细胞悬液先点几个孔 ,每孔约2μL，然后放在倒置显微镜下观察 ,如每孔 1～2 个细胞，说明细胞浓度合适 ，则可一次点完 96 孔板，每个孔100uL。
这个过程也可以使用流式细胞仪分选，直接分到96孔板中，每孔种1个细胞。
直接挑单克隆
将细胞稀释到一定浓度（具体浓度自己摸索），直接种到10cm的培养皿中，这样的目的在于，每个细胞就会均值地铺到培养皿中，最终一个细胞就会长成一团细胞，这一团细胞就是单克隆；
生长一定时间后（例如7天），放到显微镜下观察，细胞数目足够了，用记号笔在培养皿下标记上；
吸掉培养基，用PBS清洗3次，吸取2uL的胰酶，滴到标记处，消化1分钟，然后再加10uL的培养基，此时用枪头把培养基吸走，细胞就进入了枪头，再把培养基打到24孔板中，让其生长。
单克隆的鉴定
第一种方法，根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高；
第二种方法，就是提取细胞DNA，跑胶，在gRNA序列的上下游设计一对引物，产物长度约500bp，敲除的细胞的条带会缩减，由于gRNA只有20几个bp，因此普通的琼脂糖凝胶不容易看出差异，此时可以采用SDS凝胶，如果敲除的基因是非编码的序列，那么就采用测序法；
第三种方法，测序，如果不熟悉SDS凝胶，可以采用普通的琼脂糖凝胶，直接切胶，送测序；
第四种方法，如果有抗体，可以使用WB的方法。
gRNA设计网站收集
ATUM公司：https://www.atum.bio/eCommerce/cas9/input
flyCRISPR：http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder
GeneArt CRISPR Search and Design Tool（ThermoFisher）： https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/genome-editing/geneart-crispr/geneart-crispr-search-and-design-tool.html
GPP Web Portal：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design
CRISPOR：http://crispor.tefor.net/