循环外泌体PD-L1与恶性肿瘤
外泌体是一组由细胞释放、大小为30~150 nm的细胞外囊泡。人体多种细胞如内皮细胞、间充质细胞、淋巴细胞、树突状细胞、成纤维细胞以及肿瘤细胞均可释放外泌体。外泌体不是简单的细胞脱落碎片，往往携带有大量来源于母体细胞的核酸、蛋白及糖类等物质。近来研究表明，肿瘤源外泌体所携带的PD-L1在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，并可进一步促进肿瘤增殖和转移。此外，肿瘤源外泌体PD-L1被发现与患者接受抗PD1免疫治疗的响应程度有关，因此外泌体PD-L1有望成为一种新型的指导抗PD1免疫治疗标志物。在外泌体研究领域，已有大量研究聚焦于循环外泌体PD-L1在恶性肿瘤中的诊疗价值，且认为检测循环外泌体PD-L1可促进精准诊疗。然而，目前循环外泌体PD-L1检测仍然缺乏公认有效的手段，本文就循环外泌体PD-L1检测方法及其在恶性肿瘤诊疗中的价值作一综述。
外泌体PD-L1的作用机制
外泌体可通过与靶细胞识别和融合等过程传递生物调节信息，影响靶细胞的活性及功能，而肿瘤细胞具有较强的分泌外泌体功能，肿瘤来源外泌体通过作用于邻近肿瘤细胞从而导致恶性肿瘤进展（图1）。在恶性肿瘤的发生发展过程中，免疫逃逸机制发挥重要作用。肿瘤细胞可通过多种机制躲避免疫细胞杀伤效应，包括隐蔽肿瘤抗原、上皮-间充质转化、释放抑制性细胞因子以及通过直接接触抑制免疫杀伤细胞等。PD1/PD-L1信号通路是最经典的抑制细胞毒性T细胞效应的机制。在恶性肿瘤细胞及免疫抑制性细胞如调节性T细胞表面均可表达PD-L1分子，而PD-L1分子又可与免疫杀伤细胞CD8 T细胞表面的PD1受体结合，引起 CD8 T细胞功能耗竭，使其失去对肿瘤细胞的杀伤能力。肿瘤细胞也可通过释放外泌体抑制免疫杀伤细胞功能。有研究在肿瘤来源外泌体膜上发现具有PD-L1和FasL等配体，其通过与免疫杀伤细胞膜上的相应受体结合，致使靶细胞凋亡及功能耗竭。此外，外泌体PD-L1除了可直接抑制细胞毒性T细胞功能外，还可诱导免疫抑制细胞的产生，被认为在介导肿瘤免疫逃逸中发挥至关重要的作用。综上认为，外泌体PD-L1主要通过发挥广泛的免疫抑制效应，从而间接促进恶性肿瘤增殖和转移。
循环外泌体PD-L1在恶性肿瘤诊疗中的价值
外泌体PD-L1已被发现是导致肿瘤免疫抑制的一个重要因子。体外及体内实验均证实PD-L1 外泌体可抑制淋巴细胞功能，并促进肿瘤细胞增殖。因此，外泌体PD-L1水平常与恶性肿瘤患者的疾病进展及预后以及抗PD1免疫治疗效应相关，检测其水平有助于筛选合适的抗PD1治疗患者。
免疫治疗作为一种新型的恶性肿瘤治疗方式，在一定程度上弥补了传统治疗方式的不足，是充满前景的恶性肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗通过增强或激活淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应从而实现对肿瘤细胞的抑制或消除。目前FDA批准的肿瘤免疫疗法包括癌症疫苗、细胞因子、抗CTLA-4抗体、CAR-T疗法及抗PD1/PD-L1抗体疗法等。其中抗PD1/PD-L1抗体疗法因具有客观缓解率高，治疗副作用较少，适用于多种实体肿瘤类型等特点，成为免疫疗法的主流治疗手段。在临床上，恶性肿瘤患者是否适用于抗PD1治疗主要以组织病理学PD-L1检测为指征，但组织标本往往不易获取，且局部取材难以避免肿瘤异质性的问题。此外，有研究表明，组织PD-L1阴性的患者也可能产生大量的PD-L1阳性外泌体。而与组织PD-L1检测相比，检测循环外泌体PD-L1可实现无创取样，实时动态检测，且可避免局部取材带来的肿瘤异质性问题。因此，循环外泌体PD-L1有望成为一种新的抗PD1免疫治疗标志物。有研究在治疗前检测了指导抗PD1治疗的黑色素瘤患者的循环外泌体PD-L1蛋白，结果发现对治疗无响应的患者循环外泌体PD-L1水平往往很高，而低水平循环外泌体PD-L1的患者多表现为完全应答或部分应答。在黑色素瘤及非小细胞肺癌研究中也发现，循环外泌体PD-L1 mRNA表达水平与患者抗PD1治疗响应相关，经PD1单抗治疗后，响应组患者的外泌体PD-L1 mRNA 水平显著降低，而病情稳定组降低不明显，病情恶化组则显著升高。因此认为，接受抗PD1治疗的患者进行外泌体PD-L1检测有助于预测其疗效。
2.2 循环外泌体PD-L1与肿瘤监控
外泌体PD-L1可通过抑制CD8 T细胞功能协助恶性肿瘤细胞免疫逃逸，促进疾病进展。因此，循环外泌体PD-L1水平也可反映恶性肿瘤患者的疾病状况。在一项包含40例头颈鳞癌患者的临床研究中发现患者循环外泌体PD-L1水平与肿瘤分期及淋巴结转移状态高度相关（P=0.0008，0.013），认为循环外泌体PD-L1水平可间接反映患者疾病进展及免疫功能，可作为头颈鳞癌病情的监测指标。也有研究在非小细胞肺癌中发现血清外泌体PD-L1水平与肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移状态等参数相关，且与低水平血清外泌体PD-L1的患者相比，高水平患者肿瘤体积（>2.5 cm）更大（P<0.001），更易发生淋巴结转移和远处转移（P<0.05）。因此，监测血清外泌体PD-L1水平对非小细胞肺癌患者病情状态具有提示价值。此外，循环外泌体PD-L1在治疗前后的变化水平（ΔExoPD-L1）也具有重要的临床价值。一项研究纳入100例黑色素瘤患者，通过检测患者在治疗前后的ΔExoPD-L1水平并分析其与黑色素瘤治疗后进展的关系，结果显示治疗后进展患者的ΔExoPD-L1水平高于治疗后无进展患者，且以ΔExoPD-L1>100为临界值诊断黑色素瘤治疗后进展时，其灵敏度和特异度分别为83%和70% 。
2.3 循环外泌体PD-L1与肿瘤预后
外泌体PD-L1在促进恶性肿瘤进展中有重要作用，因此也往往导致患者不良预后，检测其水平对判断预后同样具有重要价值。一项研究纳入69例胃癌患者，发现术前血浆外泌体PD-L1水平与患者预后相关，与低水平血浆外泌体PD-L1组患者相比，高水平血浆外泌体PD-L1组患者的总体生存期显著缩短（P=0.004），生存分析显示血浆外泌体PD-L1是独立的预后影响因素（P=0.026）。在预测治疗后的预后方面，循环外泌体PD-L1也显示出了一定潜力。一项研究纳入55例胰腺癌患者并于术前检测其血清外泌体PD-L1，发现与血清外泌体PD-L1阴性患者相比，PD-L1阳性患者术后生存期显著缩短（9.5个月 vs 21.7个月，P<0.001）。此外，在黑色素瘤研究中也显示治疗前后的ΔExoPD-L1水平可用于预测预后，ΔExoPD-L1>100的患者较ΔExoPD-L1<100的患者总体生存期和无进展生存期显著缩短（P=0.048，0.011），说明循环外泌体PD-L1治疗前后的变化量对提示预后具有重要价值。
循环外泌体PD-L1的检测方法
循环外泌体PD-L1检测仍缺乏公认和主流的方法。传统的外泌体检测方法如酶联免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、流式分析法均可用于循环外泌体PD-L1检测，目前以ELISA法应用较为普遍。ELISA法可定量检测循环外泌体PD-L1含量，且易操作。流式分析法可用于大样本定量检测循环外泌体PD-L1，但对检测设备要求较高。随着对外泌体研究的深入，外泌体蛋白及核酸检测方法也在不断丰富和发展，一些新的方法被引入到循环外泌体PD-L1检测（图2）领域。
3.1 数字PCR
由于外泌体所含核酸量较少，因此常规检测方法难以对其基因拷贝数进行准确检测。数字PCR技术是一种具有极高灵敏度且可以绝对定量的核酸检测方法，其灵敏度可达单个核酸分子级别，因此在检测外泌体核酸含量方面具有优势。研究者利用数字PCR技术对黑色素瘤及非小细胞肺癌患者血浆外泌体中PD-L1 mRNA 拷贝数进行了精确定量分析，并据此揭示了血浆外泌体PD-L1 mRNA拷贝数与抗PD1治疗效果间的相关性。数字PCR技术的引入显著提高了外泌体PD-L1 mRNA的检测能力，对外泌体PD-L1研究具有重要意义。但外泌体PD-L1 mRNA含量与PD-L1蛋白表达量间可能存在非一致性，因此单纯检测外泌体PD-L1 mRNA可能存在一定缺陷，需进一步研究阐明。
3.2 ELISA
ELISA是传统的免疫学分析方法，常用于检测血浆或培养基中的小分子蛋白，具有较高的灵敏度且可进行定量分析。ELISA也可用于检测外泌体PD-L1蛋白，且可实现对大批量样本的定量检测。基于ELISA法原理的PD-L1蛋白检测试剂盒也被应用于血浆外泌体PD-L1蛋白定量检测中。CHEN等基于ELISA法原理构建了外泌体PD-L1蛋白检测体系，用于细胞培养基或血浆来源外泌体PD-L1蛋白检测，其线性检测范围为0.2~12.0 ng/mL。ELISA法是一种较好的外泌体PD-L1蛋白检测方法，易于定量检测、重复性好，但是由于血浆中亦存在游离的PD-L1蛋白，会干扰其准确性，因此该方法检测循环外泌体PD-L1蛋白的灵敏度与特异度仍需进一步探究。
3.3 流式分析法
流式分析法常用于对悬浮于液体中的细胞或其他生物颗粒进行分型及计数，因此该法亦被引入到外泌体检测及计数中。THEODORAKI 等首先使用层析法对头颈癌患者血浆中的外泌体进行初步分离，然后采用流式分析法对PD-L1阳性的外泌体进行检测并计数，PD-L1蛋白表达量以荧光强度表示，结果显示该方法在检测外泌体PD-L1蛋白时具有很好的重复性，对单个患者样本进行多次平行测定时，其个体内变异为7%。同时，为验证该方法的准确性，研究者以共聚焦荧光分析法作为外泌体PD-L1蛋白检测的参考方法，使用流式分析法与共聚焦荧光分析法对低值、中值、高值3例样本进行平行检测，并将结果进行比较，发现流式分析法结果与共聚焦荧光分析法结果具有较高的一致性，说明流式分析法是准确的外泌体PD-L1定量分析方法。此外，LUX等也成功利用流式分析法检测了胰腺癌患者血清中的外泌体PD-L1和c-Met蛋白表达量，但检测方法性能有待进一步研究。目前专门用于外泌体检测的流式分析仪也已上市，如Apogee超灵敏纳米流式分析仪等，相比传统流式分析仪更适合用于外泌体蛋白检测。
3.4 表面增强拉曼散射技术
表面增强拉曼散射（surface-enhanced raman scattering，SERS）技术是一种具有极高灵敏度的指纹光谱技术，已被广泛应用于生物医学领域中。目前已有学者采用SERS技术进行外泌体PD-L1蛋白检测。研究者首先利用TiO2修饰的磁珠对血浆中的外泌体进行非特异性吸附，再利用连接有PD-L1抗体的SERS探针修饰纳米金颗粒，然后将外泌体样本与纳米金颗粒共同孵育使其形成磁珠-外泌体-纳米金颗粒复合物结构，最后利用磁场将该复合物富集并分离，再置于激光共焦拉曼光谱仪上检测，从而实现对PD-L1阳性外泌体含量的检测。该方法检测灵敏度高，其最低检测限可达1 PD-L1 外泌体/μL血浆。此外，研究者利用该方法对一组不同浓度的样本进行检测，结果显示SERS强度与外泌体样本浓度对数值呈线性关系，表明该检测方法具有较好的稳定性，且可直接在血浆中检测外泌体，无需另外的外泌体分离步骤。目前将SERS技术直接应用于外泌体PD-L1蛋白检测的研究还较少，但SERS技术应用于其他外泌体检测的研究已经开展，这对外泌体PD-L1蛋白检测也具有重要的借鉴价值。
3.5 HOLMES-ExoPD-L1法
HOLMES-ExoPD-L1法是一种新颖的外泌体PD-L1蛋白检测方法。该方法设计了一种新的靶向PD-L1蛋白 MJ5C适体，可高效结合外泌体膜上的PD-L1蛋白，且不受PD-L1蛋白糖基化干扰。该方法首先将荧光标记的MJ5C适体与外泌体共孵育于细毛细管中使其相互结合，并将红外激光聚焦到细毛细管中以形成一个微米级的温度梯度。游离的MJ5C适体与外泌体MJ5C适体复合物的热泳速率显著不同，其中游离适体较外泌体-适体复合物的热泳耗竭快，据此可将游离适体从反应体系中分离出去。因此，在激发光作用下，可通过检测荧光标记的适体荧光强度测定外泌体PD-L1蛋白含量。该方法灵敏度较高，检测限为17.6 pg/mL，此外还具有所需样本量少、检测时间短等优点，是一种原创性较高的外泌体PD-L1蛋白检测方法，对开发新的外泌体PD-L1蛋白检测方法具有启示价值。
小结与展望
外泌体PD-L1在恶性肿瘤免疫治疗领应用前景广阔，已成为外泌体领域研究的热点之一。相比检测组织PD-L1表达，循环外泌体PD-L1检测更易于获取标本和开展实时检测，同时可避免病理取材带来的组织异质性问题；外泌体PD-L1也是导致肿瘤免疫逃逸的重要原因，且与恶性肿瘤进展相关，有可能成为病情评估及预后预测的重要指标。此外，血浆外泌体PD-L1水平也有望用于筛选适于抗PD1免疫治疗的患者并预测其对治疗的响应程度。然而，目前循环外泌体PD-L1检测仍缺乏公认有效的手段，有待建立分离方式简单或不需分离、样本需求量少、高灵敏度、重复性好、检测信号不易受干扰的理想循环外泌体PD-L1检测方法。循环外泌体PD-L1检测方法仍需进一步深入研究，但相信未来随着检测新方法的开发和应用，循环外泌体PD-L1将能更好地指导抗PD1免疫治疗，在恶性肿瘤诊疗中发挥更重要的作用。
作者：张武文 汪付兵
作者单位：南京医科大学附属常州第二人民医院检验科；武汉大学中南医院检验科