WB结果不理想，你内参选对了吗？

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内参对照意义

蛋白作为生命活动的承担者，一直以来都是咱们科研人的主要研究对象之一。而在众多蛋白研究方法中，Western Blot又是最常用的一种。但是对于WB实验，如果你想得要一个有意义、不被人质疑的结果，内参对照是必不可少的考量因素。

因为，要想比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对高低，前提条件是等量的细胞上样（即总蛋白浓度一致），有参照量，比较才是科学的、有意义的。对于蛋白水平测定，尤其是当表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以严谨的 Western Blot 实验设计中要求有良好的参照体系，这对实验结果分析至关重要。

内参即是内部参照（Internal Control），选取相同样本中某个内源表达的蛋白作为参照。一般来说，咱们会选择由管家基因编码的蛋白（Housekeeping Proteins）作为内参，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时可以作为一个稳定的参照物。在 WB 实验中，，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等常规步骤以外，还需要极其关键的一步，那就是内参检测，通过内参蛋白的表达量作为参照，校正蛋白定量和上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

内参选择原则

由于WB实验中，蛋白的表达情况是通过与抗体的结合而体现，因此，内参蛋白的选择问题，也等同于内参抗体的选择问题。

内参抗体种类很多，根据蛋白的亚细胞定位，咱们可以将其分为全细胞或胞浆内参、膜内参、核蛋白内参等；而其中最常见的有：β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B 等。关于内参选择，我们一般遵循以下几大原则：

1、样本种属来源：

选择内参抗体时，首先考虑实验样本来源于何物种。

a、哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择 β- actin、β- tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3 等。

b、其他稀少物种来源，可以参照文献指导或是选择高度保守管家基因表达的蛋白质相应的抗体作为内参。

2、目的蛋白分子量：

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差 5 kDa 以上但勿差距太大。比如目的蛋白分子量为 45 kDa，此时不适宜选择 β-actin 作为内参，可以考虑选择 GAPDH 或者 β- tubulin 作为内参。

3、目的蛋白表达部位：

针对一般蛋白质检测，GAPDH、β-actin 或 β-tubulin 可以满足要求，而如果需要检测亚细胞器蛋白时，适宜选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。比如常用的核内参抗体有 Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone H3。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为 ATP1A1。对于线粒体蛋白的检测，常用 VDAC1 和 COX IV 作为内参抗体。

4、特殊实验条件

以上3条原则仅针对普通情况，需要特别注意的是，内参的选择还须考虑实际实验环境状况，部分情况下管家基因的表达量也会发生改变。

比如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达量增高，此种状况下 GAPDH 不适合做内参；在涉及细胞增殖相关实验中，c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参；在凋亡实验中，TBP、Lamin 等不适合作为核内参。因此在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。

差异化内参推荐

总之，对于WB实验而言，没有内参作为参照，或者内参选择不合适，实验结果就会完全失去意义。针对不同靶标蛋白，我们要依照其蛋白特性和实验条件差异化的选择最佳内参（抗体）。

根据相关文献及抗体引用记录，咱们整理了一份内参推荐表，以供参考。

Proteintech内参抗体推荐表 

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喏，以上就是本次分享的全部内容，

机智的你们，都学会了吗？