【前沿技术】CRISPR/dCas9技术带你玩转分子互作

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不知道大家有没有发现，最近几年有一项技术非常火爆，相信科研圈的小伙伴们都不陌生，那就是CRSPR-Cas9技术。

自从2012年CRISPR-Cas9系统首次被用于DNA的精准编辑以来，在短短几年时间内迅速走红科研圈，被广泛应用于多个物种细胞、个体的基因敲除，随后衍生出的不同CRISPR-Cas系统更是实现了基因的敲减、敲入、激活以及RNA的编辑，开启了基因精准编辑的新纪元，自此基因编辑进入了CRISPR时代。

然而你以为CRISPR-Cas系统只能用于核酸编辑？NoNoNo......

只需简单的基因工程改造，就能利用CRISPR/Cas进行DNA、RNA互作分子的挖掘和筛选。

今天要为你介绍的dCas9-ChIP技术就是对Cas9蛋白进行一些位点突变，与ChIP联用实现核酸的富集以及DNA-RNA-蛋白的互作验证。话不多说，先上文章。

这篇2020年发表在《Journal of Hematology & Oncology》（影响因子5年内从5升到11，真是潜力股啊）上的文章为了研究lncRNA HUMT与转录因子YBX1共同调控FOXK1转录表达的机制，就用到了这项看似高大上，实则接地气的技术。

以往如果我们想要证明lncRNA与转录因子结合调控基因表达的分子机制，常常需要以下几个步骤：

1、RIP、RNA-pull down实验先证明lncRNA与转录因子互作；

2、ChIP实验证明转录因子结合基因的启动子；

3、DNA-RNA杂交（Northern blot）证明lncRNA与基因启动子结合。

这样做实验不仅耗时耗力，还非常烧经费。有的同学会说，那就用ChIRP（与ChIP对应，一种验证RNA、蛋白和DNA结合的免疫共沉淀技术），可以通过生物素标记的RNA探针结合目标RNA，直接把蛋白和启动子DNA一起沉淀下来。

但是，如果lncRNA不直接结合启动子DNA序列，只是辅助转录因子结合的呢？这时dCas9-ChIP就可以闪亮登场了。

Cas9蛋白结构示意图[1]

说到这项技术，首先要来说说什么是dCas9。众所周知，我们常用的Cas9蛋白分为几个结构域：结合sgRNA的REC结构域，PI结构域以及负责DNA切割的HNH和RuvC结构域（如上图所示）。如果将HNH和RuvC的切割位点突变又不改变蛋白质的整体结构，那么就可以实现Cas9仅被sgRNA招募到DNA上结合，而不行使编辑功能。

如果进一步在Cas9的一端融合表达标签或荧光蛋白（Flag、GFP等），那我们就可以实现用标签抗体将Cas9结合的DNA以及DNA上结合的分子全部沉淀下来的目的。

这一被改造后失去切割活性的Cas9蛋白就被命名为dCas9（deficient Cas9）。

dCas9-ChIP技术示意图[2]

说回到这篇文章，作者首先设计靶向位点的sgRNA，再和dCas9-Flag一同转入细胞，然后按ChIP的方法将细胞交联后裂解，用带有Flag标签抗体的Beads将dCas9连同交联在一起的所有分子都沉淀下来，最后将DNA/RNA/蛋白质解交联并分别提取，进行 RT-qPCR、Western blot 或测序/芯片/质谱分析，就可以定量检测目标RNA/蛋白含量，或是寻找未知的结合分子。

看似复杂，实则一步到位，将所有直接或间接结合的分子全部找到。

私以为这样的方法非常适合寻找特定启动子位点的结合分子，不仅操作简单、高效，转入dCas9系统的细胞还能保留下来进行后续验证实验。检测结果如下图。

RT-qPCR检测lncRNA表达，gCT和IgG为阴性对照。

这样好用的方法当然不是作者独创，早在2014年弗吉尼亚大学的研究团队就利用dCas9的方法检测CRSPR/Cas9系统的脱靶率。

作者将12条sgRNA和dCas9转入HEK293T细胞，并以未失活的Cas9作为对照，用常规的ChIP-seq方法检测与Cas9蛋白结合的DNA，这样就能找到CRSPR/Cas9系统在目标位点以外编辑的位置[3]。

此外，由于表达丰度低，常规方法如RNA-pull down、DNA-pull down遗漏（难以捕捉到）的分子，也可以通过dCas9进行深度挖掘。2018年的1篇文章就通过类似的方法进行组蛋白基因调控因子的研究。

在PNAS上发表的这篇论文通过dCas9-sgRNA复合体找到调控组蛋白H2A的转录因子Vig和Vig2。此处的研究目标是与特定启动子结合的蛋白（转录因子），使用的是体外结合方法，操作流程与前文稍有不同。

首先将细胞交联后裂解，在裂解液中加入体外表达的dCas9-sgRNA复合体，再加入FLAG标签抗体，共沉淀后纯化，洗脱结合的分子，根据需要提取DNA和蛋白，进行RT-qPCR和质谱分析（见下图）[4]。

dCas9流程示意图[4]

总结一下，Cas9-ChIP技术实际上就是综合了RIP功能的高配版ChIP，通过外源的dCas9蛋白和sgRNA实现目标核酸的富集和特定位点调控复合体的检测。比起平时比较常用的RIP、ChIP、RNA-pull down、DNA-pull down技术，dCas9有以下优势：

（1）省时高效，与ChIP的步骤相似，就能一次获得想要找的所有分子；

（2）精准靶向，可以一次设计多条sgRNA，或使用sgRNA文库靶向目标DNA区域；

（3）操作简单，只需在细胞中表达dCas9和sgRNA，就能用实验室已有的ChIP体系完成后续步骤，不同的目标DNA只需设计不同的sgRNA即可。

（4）条件限制少，由于dCas9可以富集靶序列，不会受到目标序列或者结合分子丰度低的影响，能更全面地获得与靶基因结合的分子，尤其是复合体的成分。

尽管dCas9确实是一个便捷好用的工具，在使用之前还是要进行合理的实验设计，保证实验能够顺利进行。

首先，sgRNA的设计就要考虑以下几个方面：

①需要设计几条sgRNA靶向目标基因，分别是哪几个位点；

②为了避免对dCas9产生空间位阻，设计sgRNA时尽量使其结合在外侧；③sgRNA和dCas9的结合及引导效率如何，这里就需要先进行预实验确定实验条件。

此外，还需根据实际情况和课题需要，选择体外结合还是细胞内交联；由于靶向的位点可能会有众多结合分子，增加假阳性率，因此设置合适而足够的对照，以及后续的验证实验非常重要。

相信通过本文，你已经初步掌握了dCas9技术的原理和基本操作流程。不妨在下次探索DNA结合蛋白/RNA时考虑尝试一下这个方法，说不定会有意外的发现哦。

如果你对CRISPR/Cas9技术感兴趣，欢迎在评论中留言~ 

参考文献：

[1] Chen Weizhong, Zhang Yifei, Yeo Won-Sik et al. Rapid and Efficient Genome Editing in Staphylococcus aureus by Using an Engineered CRISPR/Cas9 System[J]. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139: 3790-3795.

[2] Zheng Shaoquan,Yang Lu,Zou Yutian et al. Long non-coding RNA HUMT hypomethylation promotes lymphangiogenesis and metastasis via activating FOXK1 transcription in triple-negative breast cancer[J]. J Hematol Oncol, 2020, 13: 17.

[3] Kuscu Cem,Arslan Sevki,Singh Ritambhara et al. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32: 677-83.

[4] Tsui Chiahao, Inouye Carla, Levy Michaella et al. dCas9-targeted locus-specific protein isolation method identifies histone gene regulators[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2018, 115: E2734-E2741.