人肠道类器官组织细胞悬液制备流程

本protocol仅供参考，还请根据自己的组织和实际的实验设计进行相应的替换

背景介绍

类器官属于三维（3D）细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。2009 年，来自荷兰 Hubrecht 研究所的 Hans Clevers 等人首次发现在没有间充质生态位的情况下，单个肠道 Lgr 5 干细胞仍然可以长成隐窝绒毛结构，并且证实了单个 Lgr5 肠干细胞可以在其所处的环境中独立存在，产生一种不断扩展的、自我更新的上皮结构，该结构与正常肠道相似，称之为肠道类器官。由于肠道类器官由肠道干细胞组成，其组成较为松散，我们使用温和的TrypLE™ Express Enzyme重组蛋白酶对肠道类器官组织进行解离。

肠道类器官干细胞示意图

实验试剂及耗材

表1. 人肠道类器官组织解离部分试剂耗材参考表

图2 Wash Buffer和Lysis Buffer配置方法

实验步骤

1. 在37℃下，将类器官组织放在TrypLE中孵育20min。
2. 每隔5 min，用吸管将细胞悬液吹吸5-10次，用血细胞计数仪检查消化进度，直到有足够的单细胞出现。
3. 对于新鲜解离的细胞，用PBS+0.04%BSA（20µL BSA/1 mL 1X PBS）进行1-2次清洗。使用血细胞计数器洗涤后确定细胞计数。
4. 在2 mL的试管中加入100,000-1,000,000个细胞的细胞悬液。
5. 4 ℃ 下，300rcf 离心5 min。
6. 在不破坏细胞沉淀的情况下去除所有上清液。
7. 添加 100 µL 预冷的裂解缓冲液。移液枪吹吸 10 次。
8. 冰上孵育 4 min。
9. 向裂解的细胞中加入 1 mL预冷的洗涤缓冲液。移液枪吹吸5次。
10. 4 ℃ 下，500 rcf 离心5 min。
11. 在不破坏细胞沉淀的情况下去除所有上清液。
12. 用预冷的细胞缓冲液重悬细胞。
13. 使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞的数量和活力。

• 可选：如果观察到细胞碎片和大团块，请过细胞滤膜过滤。对于小体积，使用 40 µm Flowmi 细胞滤膜以最大程度地减少体积损失。

制备结果及注意事项

细胞量：90万左右，活率95%以上，结团率22.4%

注意：肠道类器官组织细胞易破碎，吹打时尽量轻柔，避免产生碎片杂质。