巨噬细胞疗法，向着实体瘤出发
近几年来，基因修饰的T细胞在用于治疗血液恶性肿瘤上获得了许多可喜的结果，但在实体瘤中却疗效不佳，仍然面临着很多挑战，这促使着研究学者们将目光转移到其它免疫细胞上，希望从中开发出新的替代疗法。
11月18日，来自美国Carisma Therapeutics和宾夕法尼亚大学的几位研究学者在Cancer Research上发表了题为“Macrophage-basedapproaches for cancer immunotherapy”的综述报告，概述了巨噬细胞免疫疗法所取得的进展，以及嵌合抗原受体巨噬细胞疗法的兴起。
实体瘤的过继细胞疗法
在癌症治疗中，免疫细胞的过继转移是一种很有希望的方法。截至目前，全球获FDA批准上市的CAR-T产品有3个，均用于治疗B细胞恶性肿瘤，此外，有200多个针对各种血液系统恶性肿瘤的临床试验处于active/enrolling状态。
相比之下，CAR-T细胞疗法在实体瘤中的进展则比较缓慢。原因有很多，例如，CAR-T细胞必须穿过粘附分子减少的异常肿瘤血管系统，再经历趋化因子/趋化因子受体的不匹配，而且必须通过致密的细胞和基质屏障。而当CAR-T细胞进入肿瘤微环境（TME）后，效应细胞会遇到一些不利条件，如缺氧和酸性环境、免疫检查点配体的表达以及TME中大量的免疫抑制细胞。即使CAR-T细胞在TME中能侥幸存活，实体瘤表面抗原表达的异质性也可能使其逃脱检测，使得肿瘤不能被完全清除。
CAR研究的主要焦点一直是外周T淋巴细胞，但近年来利用嵌合受体进行癌症治疗的研究已经扩展到了其它类型的淋巴免疫细胞中，如γδT细胞、自然杀伤T（NKT）细胞和自然杀伤（NK）细胞。但由这些淋巴细胞衍生的细胞疗法在实体瘤治疗中的疗效仍然难以捉摸，而髓系细胞（如单核/巨噬细胞）则为这些难题提供了一种可能的解决方案，因为这些细胞在肿瘤中的积累良好，并能穿透肿瘤周围致密的基质组织。此外，髓系细胞既能直接杀伤肿瘤，又能通过抗原呈递增强内源性免疫，这些特点使髓系细胞成为抗肿瘤细胞疗法开发的独特选择。
癌症中的巨噬细胞
巨噬细胞具有清除细胞碎片和病原体，调节炎症反应等多种功能。巨噬细胞还是一种高度可塑的细胞，可以根据微环境刺激和信号的不同从一种表型转换到另一种表型。巨噬细胞的激活状态通常被简化为两类：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。
M1和M2巨噬细胞极化状态的表型特征（来源：Nature Reviews Immunology）
M1型巨噬细胞由辅助性T细胞（Th）1的细胞因子诱导而来，能通过分泌TNFα、IL-1β和IL-12等细胞因子促进Th1细胞介导的炎症反应，并通过分泌趋化因子CXCL9和CXCL10增强炎症部位Th1细胞的招募。此外，M1巨噬细胞还能上调参与抗原处理和呈递的基因，增强T细胞的应答。
M2巨噬细胞在正常免疫功能和稳态中具有关键作用，如刺激Th2细胞反应、消除寄生虫、免疫调节、伤口愈合和组织再生等，但某些M2巨噬细胞亚群在促进肿瘤进展中也起着关键作用。肿瘤能将循环单核细胞和组织常驻巨噬细胞招募到TME，并使其极化为M2表型，再通过各种可溶性和机械因子形成肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。TAM通过促进基因不稳定、血管生成、纤维化、免疫抑制、侵袭和转移来增强肿瘤进展。基于巨噬细胞的癌症治疗的一个核心目标是减少抗炎性巨噬细胞，增加促炎性（抗肿瘤）巨噬细胞。
靶向癌症中的TAM
当前，抵抗TAM促肿瘤特性的策略可以分为两组：减少TAM的数量或改变TAM在TME内的功能。
最成熟的减少TAM存活的方法是通过阻断集落刺激因子-1（CSF-1，也称为M-CSF）/CSF1R轴，这是巨噬细胞分化和存活的重要配体-受体对。这种方法通过阻断单核细胞分化来减少TAM的数量，同时也减少了现有TAM的存活率。此外，使用靶向CSF1R的小分子抑制剂可诱导TAM的复极化，从M2转为M1型。
也有研究团队关注靶向其它重要受体，在TME内重编程TAM的疗法。其中，Toll样受体（TLR）是一类参与先天免疫感应的受体家族，可以改变巨噬细胞的表型。这些模式识别受体可以对细菌颗粒（如脂多糖）或细菌和病毒的基因组（如DNA或RNA）作出反应，触发促炎细胞因子的释放。腔内注射TLR激动剂已被证明可以增加单核细胞的招募和浸润，并诱导巨噬细胞的复极化。
TAM重编程的另一个的靶点是CD40，它与活化的T细胞上表达的CD40L结合。CD40信号能使共刺激分子和促炎细胞因子上调，CD40激动剂抗体可以延缓肿瘤的进展并使先前耐药的肿瘤对化疗敏感。
另一个值得关注的分子是TGFβ，这种抗炎分子通常由巨噬细胞在损伤修复过程中表达。TGFβ能降低TAM对I型干扰素和STING激动剂的敏感性，增加了TAM向炎症表型转化的难度。在小鼠模型中阻断TGFβ，同时使用STING激动剂治疗能通过上调I型干扰素的表达来实现肿瘤消退。
但是，原位靶向TAM也有很大的缺点。首先，也是最重要的一点，TME是由众多的免疫抑制细胞组成的，具有功能冗余性。这些细胞都在疾病的进展中起着一定的作用，不太可能通过靶向单一细胞类型来实现TME的充分改变，达到根除肿瘤的作用。此外，在治疗过程中产生的任何临床益处可能只是暂时的，并不能反映TME的根本改变。
体外改造巨噬细胞
因此一些研究团队尝试在体外改造巨噬细胞，作为原位改变TAM的替代方法。在20世纪80年代末，德国的Andreesen小组首次利用体外培养的巨噬细胞治疗癌症，15例经标准治疗失败的晚期癌症患者接受了这种从单核细胞衍生的巨噬细胞疗法。
具体来说，研究人员从白细胞中分离出单核细胞，再用患者的自体血清培养7天，使其分化为巨噬细胞。在给患者使用之前，研究人员用IFN-γ对巨噬细胞进行"教育"，将其诱导为M1表型。然后通过静脉或腹腔注射将这些巨噬细胞注入患者体内，每次注射的剂量高达1.7×109个细胞。
虽然在治疗后肿瘤原发部位没有明显的消退，但部分患者在治疗后6个月内病情保持稳定。7例腹膜癌患者在接受腹腔内巨噬细胞注射后，有2例腹水消失。15例患者中有7例血清中的IL-6升高，这表明疗法诱导了炎症反应。关键的是，除了低热和腹腔注射后的腹部不适外，没有其它副作用被报道。
后来的研究利用类似的方法生产IFN-γ激活的巨噬细胞——MAK（macrophage activated killer）细胞，这类细胞在体外和临床前模型中显示出对细胞系的抗肿瘤活性，而且巨噬细胞的给药似乎是安全的，没有与治疗相关的高等级毒性的报告。
值得注意的是，这些非工程化的巨噬细胞无法识别肿瘤相关抗原，也无法吞噬癌细胞。此外，由于巨噬细胞的极化是一个连续的过程，会随着外界刺激的变化而变化，因此TME有可能将过继转移的巨噬细胞从IFN-γ激发的M1表型转向M2表型。以上这些表明巨噬细胞疗法的开发需要添加靶向激活受体和更持久的M1巨噬细胞极化方法。
CAR-M疗法浮出水面
为了解决这些问题，利用基因改造来提升巨噬细胞的抗肿瘤能力逐渐吸引了更多的关注。
根据作者团队在2016年报道的人体CAR巨噬细胞（CAR-M）的初步进展。他们发现嵌合腺病毒载体Ad5f35能高效、可重复地转导原代单核细胞和巨噬细胞，以75%以上的效率和高生存力递送CAR基因。值得注意的是，用Ad5f35生成的CAR-M在体外和体内比对照组或M1巨噬细胞能更有效地消除肿瘤细胞。而且在异种移植小鼠模型中，与使用对照巨噬细胞治疗的小鼠相比，CAR-M治疗后小鼠的肿瘤负担显著降低，总生存率也升高了。
用Ad5f35转导的巨噬细胞会表现出持久的M1表型，CAR-M还诱导了周围TME的促炎特征。而且M2巨噬细胞的存在并不影响CAR-M的肿瘤杀伤能力，这凸显了它们对TME免疫抑制的抵抗力。此外，CAR-M表现出更强的T细胞刺激能力，能够在吞噬后将抗原呈递给T细胞。而且在趋化实验中，CAR-M能同时招募静止和活化的T细胞。
这些结果表明CAR-M有潜力克服细胞疗法在实体瘤环境中遇到的一些关键难点，代表了一种新型的免疫治疗平台。
值得注意的是，虽然CAR-M的直接抗肿瘤活性是依赖于靶点的，但M1表型是不依赖于靶点的，因此CAR-M有可能对TME进行重编程，并在具有异质性靶抗原表达的肿瘤中发挥抗肿瘤活性。这些工程化的巨噬细胞结合了髓系细胞的肿瘤迁移能力、永久的促炎M1表型、CAR介导的靶向抗肿瘤活性和专业的抗原呈递能力，能启动多模式的抗肿瘤免疫应答。
CAR-M疗法的多效抗肿瘤机制（来源：Cancer Research）
结语
巨噬细胞是一种高度可塑性的细胞，能够根据外部刺激调整自身的特性和功能。作为专业的抗原呈递细胞，巨噬细胞将先天效应器功能与适应性免疫进行了衔接。而基因工程的巨大进展则为利用合成生物学重新引导巨噬细胞抗肿瘤提供了更大的可能。