为什么CD4阳性T细胞并不是表达CD4最多的

大家已经跟着我们跑了很多次我们对官方 pbmc3k 例子， 只需要自己按照如下所示链接下载 pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz 并且解压即可，然后使用 Seurat 包里面的 Read10X 函数读取解压好的文件夹路径：

标准代码如下所示 ：

library(Seurat)
# https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
## Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_gene_bc_matrices/hg19/")

## Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", 
                           min.cells = 3, min.features = 200)
## Identification of mithocondrial genes
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

## Filtering cells following standard QC criteria.
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & 
                 percent.mt < 5)

## Normalizing the data
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", 
                      scale.factor = 10000)

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

## Identify the 2000 most highly variable genes
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

## In addition we scale the data
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc), 
               verbose = FALSE)
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10, verbose = FALSE)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5, verbose = FALSE)
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10, umap.method = "uwot", metric = "cosine")
table(pbmc$seurat_clusters)
# pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25,  logfc.threshold = 0.25, verbose = FALSE)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by = 'seurat_clusters',
        label = TRUE, pt.size = 0.5) 
DotPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", 
                               "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", 
                               "LYZ", "PPBP", "CD8A"),
        group.by = 'seurat_clusters')
## Assigning cell type identity to clusters
new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T",
                     "FCGR3A+ Mono", "NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()
 
pbmc$cluster_by_counts=Idents(pbmc)
table(pbmc$cluster_by_counts)

虽然是进行初步生物学命名，看起来合情合理：

初步生物学命名

但是我在检查CD4基因表达量的时候，发现了很有意思的现象：

各个细胞亚群，都是有CD4基因表达的

可以看到各个细胞亚群，都是有CD4基因表达的，我们虽然命名了 Naive CD4 T和Memory CD4 T"，但是它们并没有特异性的高表达CD4基因哦！

上面的可视化代码如下所示：

sce=pbmc
sce$celltype=Idents(sce)

p1=FeaturePlot(sce,'CD4')
p2=DimPlot(sce, reduction = "umap", 
        label = TRUE, repel = T,pt.size = 0.5) + NoLegend()
p3=VlnPlot(sce,'CD4',group.by = 'celltype')
library(patchwork)
p1+p2
p1+p3 

这个时候有粉丝提问，能不能在第一幅图umap里面，加上第二幅图FeaturePlot看CD4基因表达信息。文献出处是：《IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis》

如下所示，可以看到 作者其实就是想展现IL-11这个基因呢，在其中一个fibroblasts细胞亚群里面是表达量比较高！

其中一个fibroblasts细胞亚群里面是表达IL-11这个基因

我查了一下， Seurat 包里面确实没有这个函数，不过 Seurat 包绘制的图形都是ggplot体系，所以比较容易自定义。

其实上面的图就是在umap上面叠加FeaturePlot信息，我给出来的代码如下所示：

p2=DimPlot(sce, reduction = "umap", 
        label = TRUE, repel = T,pt.size = 0.5) + NoLegend()
pos=sce@reductions$umap@cell.embeddings
pos=pos[sce@assays$RNA@counts['CD4',]>1,]
head(pos)
library(ggplot2)
p2+geom_point(aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2), 
              shape = 21, colour = "black",
              fill = "blue", size = 0.5,  
              data = as.data.frame(pos))

效果如下所示：

在umap上面叠加FeaturePlot信息

首先需要对seurat对象有所理解

代码并不多，首先需要对seurat对象有所理解！单细胞数据看起来种类很多，有CEL-seq、MARS-seq、Drop-seq、Chromium 10x和SMART-seq的fastq数据。但是最终都是得到表达量矩阵哦， 大家通常是5个R包，分别是: scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop，需要熟练掌握它们的对象，：一些单细胞转录组R包的对象 而且分析流程也大同小异：

  • step1: 创建对象
  • step2: 质量控制
  • step3: 表达量的标准化和归一化
  • step4: 去除干扰因素(多个样本整合)
  • step5: 判断重要的基因
  • step6: 多种降维算法
  • step7: 可视化降维结果
  • step8: 多种聚类算法
  • step9: 聚类后找每个细胞亚群的标志基因
  • step10: 继续分类

如果你也对10x单细胞转录组感兴趣，参考我们的《明码标价》专栏里面的单细胞内容

单细胞转录组数据分析的标准降维聚类分群，并且进行生物学注释后的结果。可以参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释 ，我们演示了第一层次的分群。

如果你对单细胞数据分析还没有基础认知，可以看基础10讲：

其次需要对ggplot语法有所了解

一张统计图就是从数据到几何对象（点、线、条形等）的图形属性（颜色、形状、大小等）的一个映射。

  • ✦ 数据（Data），最基础的是可视化的数据和一系列图形映射（aesthetic mappings），该映射描述了数据中的变量如何映射到可见的图形属性。
  • ✦ 几何对象（Geometric objects, geoms）代表在图中实际看到的点、线、多边形等。
  • ✦ 统计转换（Statistical trassformations, stats）是对数据进行某种汇总，例如将数据分组创建直方图，或将一个二维的关系用线性模型进行解释。
  • ✦ 标度（Scales）是将数据的取值映射到图形空间，例如用颜色、大小或形状来表示不同的取值，展现标度的常见做法是绘制图例和坐标轴。
  • ✦ 坐标系（Coordinate system, coord）描述数据是如何映射到图形所在的平面，同时提供看图所需的坐标轴和网格线。
  • ✦ 分面（faceting）如何将数据分解为子集，以及如何对子集作图并展示。
  • ✦  主题（theme）控制细节显示，例如字体大小和图形的背景色。

ggplot2作者亲自写的书

链接：https://ggplot2-book.org/facet.html

书名是：ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis 作者：Hadley Wickham

This is the online version of work-in-progress 3rd edition of “ggplot2: elegant graphics for data analysis”

虽然这本书有对应的中文译本，但是时间上相对滞后，建议直接看这个在线实时更新版本。

Getting started

  • 1 Introduction
  • 2 Getting started with ggplot2
  • 3 Frequently asked questions
  • II Toolbox

Introduction

  • 4 Individual geoms
  • 5 Collective geoms
  • 6 Statistical summaries
  • 7 Maps
  • 8 Annotations
  • 9 Arranging plots

III The Grammar

  • 10 Mastering the grammar
  • 11 Build a plot layer by layer
  • 12 Scales, axes and legends
  • 13 Coordinate systems
  • 14 Facetting
  • 15 Themes

IV Extending ggplot2

  • 16 Programming with ggplot2
  • 17 ggplot2 internals
  • 18 Writing ggplot2 extensions
  • 19 Extension Case Study: Springs, Part 1
  • References

看完你一定会觉得不虚此行！至少花十天时间哦。

知识点参考卡片（速记表，小抄）

链接：https://ggplot2.tidyverse.org/reference/

内容如下：

  • Plot basics
  • Layer: geoms
  • Layer: stats
  • Layer: position adjustment
  • Layer: annotations
  • Aesthetics
  • Scales
  • Guides: axes and legends
  • Facetting
  • Facetting: labels
  • Coordinate systems
  • Themes
  • Programming with ggplot2
  • Extending ggplot2
  • Vector helpers
  • Data
  • Autoplot and fortify

读这个知识点参考卡片，可以检验你ggplot2语法的记忆程度。

sthda网站的ggplot核心图表示例

链接：http://www.sthda.com/english/wiki/ggplot2-essentials

书籍本身提供售卖，价格是17欧元，不过内容都是电子化了，大家直接网页浏览，就是免费的哈！

内容：

  1. qplot(): Quick plot with ggplot2
    • Scatter plots
    • Bar plot
    • Box plot, violin plot and dot plot
    • Histogram and density plots
  2. Box plots
    • Change box plot line colors
    • Change box plot fill colors
    • Basic box plots
    • Box plot with dots
    • Change box plot colors by groups
    • Change the legend position
    • Change the order of items in the legend
    • Box plot with multiple groups
    • Functions: geom_boxplot(), stat_boxplot(), stat_summary()

··· 中间省略 25个章节

  1. Rotate a plot: flip and reverse
  • Horizontal plot : coord_flip()
  • Reverse y axis
  • Functions: coord_flip(), scale_x_reverse(), scale_y_reverse()
  1. Faceting: split a plot into a matrix of panels
  • Facet with one variable
  • Facet with two variables
  • Facet scales
  • Facet labels
  • facet_wrap
  • Functions: facet_grid(), facet_wrap(), label_both(), label_bquote(), label_parsed()

内容之丰富，起码需要五天左右时间完全follow下来。

还包括以下扩展包：

  • factoextra - Extract and Visualize the outputs of a multivariate analysis: PCA (Principal Component Analysis), CA (Correspondence Analysis), MCA (Multiple Correspondence Analysis) and clustering analyses.
  • easyggplot2: Perform and customize easily a plot with ggplot2: box plot, dot plot, strip chart, violin plot, histogram, density plot, scatter plot, bar plot, line plot, etc, …
  • ggplot2 - Easy way to mix multiple graphs on the same page
  • ggplot2: Correlation matrix heatmap. Functions: geom_raster() and geom_tile()
  • ggfortify: Allow ggplot2 to handle some popular R packages. These include plotting 1) Matrix; 2) Linear Model and Generalized Linear Model; 3) Time Series; 4) PCA/Clustering; 5) Survival Curve; 6) Probability distribution
  • GGally: GGally extends ggplot2 for visualizing correlation matrix, scatterplot plot matrix, survival plot and more.
  • ggRandomForests: Graphical analysis of random forests with the randomForestSRC and ggplot2 packages.
  • ggdendro: Create dendrograms and tree diagrams using ggplot2
  • ggmcmc: Tools for Analyzing MCMC Simulations from Bayesian Inference
  • ggthemes: Package with additional ggplot2 themes and scales
  • Theme used to create journal ready figures easily

ggplot2之所以备受推崇，就是因为它已经成为了一个生态，层出不穷的新奇想法会在它的基础上面生长起来。

绘图菜谱

链接：http://www.cookbook-r.com/Graphs/

这个有中文翻译版本，务必直接下单购买，放在书桌旁边随时翻阅。

内容：

  1. Bar and line graphs (ggplot2)
  2. Plotting means and error bars (ggplot2)
  3. Plotting distributions (ggplot2) - Histograms, density curves, boxplots
  4. Scatterplots (ggplot2)
  5. Titles (ggplot2)
  6. Axes (ggplot2) - Control axis text, labels, and grid lines.
  7. Legends (ggplot2)
  8. Lines (ggplot2) - Add lines to a graph.
  9. Facets (ggplot2) - Slice up data and graph the subsets together in a grid.
  10. Multiple graphs on one page (ggplot2)
  11. Colors (ggplot2)

学了那么多语法，就在菜谱里面把握细节吧！

最后一个是 https://stackoverflow.com/

你会发现，你想实现的各种稀奇古怪的绘图需求，只需要你能使用英文描述出来，就是能找到答案的！

  • 用谷歌搜索来使用ggplot2做可视化（上）：https://mp.weixin.qq.com/s/WN4TSMNjH4b6vZgYVjaRvQ
  • 用谷歌搜索来使用ggplot2做可视化（下）：https://mp.weixin.qq.com/s/_Q16zDZgCr3XoO0r3wqRkw

如果我说，全部学完，需要一年的时间，不知道你还是否愿意入坑呢？

不过，如果你是R语言都没有掌握好，那么可能需要先学习我给初学者的六步系统入门R语言，知识点路线图如下：

  • 了解常量和变量概念
  • 加减乘除等运算（计算器）
  • 多种数据类型（数值，字符，逻辑，因子）
  • 多种数据结构（向量，矩阵，数组，数据框，列表）
  • 文件读取和写出
  • 简单统计可视化
  • 无限量函数学习
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