抗PD-1联合曲美替尼抑制肿瘤生长并提高小鼠肝内胆管癌的存活率</font></font> / 开普饭

背景与目标

肝内胆管癌 (iCCA) 占原发性肝癌的一小部分，但 5 年生存率仅为 10%。免疫检查点抑制剂可有效治疗许多实体癌，但免疫检查点抑制剂单药治疗对 iCCA 没有明显益处。丝裂原活化激酶 (MEK) 抑制剂，如曲美替尼，通过抑制细胞增殖和改变肿瘤微环境，在 iCCA 的临床前研究中显示出有希望的结果。本研究旨在展示曲美替尼与抗程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 治疗在不同 iCCA 小鼠模型中的潜在益处。

方法

在这里，我们评估了曲美替尼在小鼠（SB1 和 LD-1）和人（EGI-1）胆管癌细胞系中的体外细胞毒性。我们在皮下、原位和质粒诱导的 iCCA 小鼠模型中检查了单药曲美替尼、抗 PD-1 以及两者组合的疗效。流式细胞术分析用于阐明治疗后肿瘤免疫微环境的变化。对 SB1 肿瘤细胞系进行全外显子组测序 (WES)，以将这种临床前模型与患者的 iCCA 相关联。

结果

Trametinib 在体外减少了 SB1、LD-1 和 EGI-1 肿瘤细胞的肿瘤细胞生长。曲美替尼治疗导致体外肿瘤细胞上主要组织相容性复合物 (MHC-I) 和程序性细胞死亡配体 1 (PD-L-1)（程序性细胞死亡配体 1）的上调。与单独使用任何一种药物相比，曲美替尼和抗 PD-1 的组合在几种 iCCA 肿瘤模型中降低了肿瘤负荷，并提高了 SB1 荷瘤小鼠的存活率。荷瘤小鼠的免疫分析显示肝脏效应记忆 CD8 ⁺和 CD4 ⁺ T 细胞增加，以及 CD8 ⁺脱粒增加T 细胞，表明细胞毒性增强。WES 和体细胞突变分析显示 SB1 肿瘤细胞中没有 KRAS、BRAF 和 ERK 突变，并且在 iCCA 患者队列中发现了类似的 SB1 遗传特征。

结论

总之，我们的研究表明，曲美替尼通过上调 MHC-I 表面表达来提高肿瘤细胞的免疫原性。与抗 PD-1 的组合导致 iCCA 的最佳治疗效果。SB1 细胞的 WES 表明 KRAS 野生型 iCCA 也对这种联合疗法有反应。

图形概要

Graphical Abstract

关键词

本文中使用的缩写：

IC50（中值抑制浓度）、iCCA（肝内胆管癌）、ICI（免疫检查点抑制剂）、IFNγ（γ干扰素）、KRASwt（KRAS野生型）、MHC-1（主要组织相容性复合物）、PBS（磷酸盐缓冲盐水）、PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）、PD-L1（程序性细胞死亡配体1）、WES（全外显子组测序）)

概括

免疫检查点抑制剂不适用于肝内胆管癌。在这里，我们表明曲美替尼提高了肿瘤细胞的免疫原性，导致曲美替尼和抗 PD-1 的组合在不同的临床前模型中产生了强烈的反应。

肝内胆管癌 (iCCA) 占原发性肝癌诊断的 15%，预后不佳，5 年生存率仅为 10%。

iCCA 的全球发病率约为每 100,000 人 1.6 例。

尽管大多数 iCCA 病例发生在没有危险因素的个体中，但可识别的危险因素包括丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、炎症性肠病和原发性硬化性胆管炎。

⁴

手术切除是 iCCA 的主要根治性治疗方法，但仅有 20%~40% 的患者适合手术切除。

⁵

对于不可切除的早期疾病患者和对新辅助治疗有反应的患者，肝移植都是一种潜在的选择，

⁶

但许多患者不符合标准。如果疾病无法手术但仍存在肝内，可以使用局部治疗，例如射频消融或经动脉化疗栓塞。

⁷

不可切除疾病的全身治疗以吉西他滨为基础，但疗效有限，中位生存期仅为 12 个月。

⁷

最近，免疫检查点抑制剂 (ICIs) 在肝细胞癌患者中显示出有希望的结果，但 ICIs 在 iCCA 中的作用在很大程度上是未知的。

⁸

⁹

正如 Loeuillard 等人在一篇评论中所讨论的那样，

¹⁰

ICI 单一疗法对大多数 iCCA 患者的疗效有限，并且正在进行研究以探索它们与局部疗法、免疫微环境调节剂和分子靶向疗法的潜在组合。

RAS-RAF-MEK-ERK 通路中的突变是几种癌症进展的常见机制。虽然 KRAS 是 iCCA 中常见的突变位点，但仅在 18% 的 iCCA 中发现 KRAS 突变。

¹¹

突变的 KRAS 导致 MEK（丝裂原活化蛋白激酶/ERK 激酶）蛋白的持续下游活性。MEK抑制剂，如trametinib和cobimetinib，被批准用于治疗BRAF突变的黑色素瘤和非小细胞肺癌，

¹²

¹³

并且正在许多其他癌症类型中进行研究，包括胆道癌。最近的一项小鼠研究表明，KRAS 野生型 (KRASwt) 肿瘤也通过调节肿瘤微环境对 MEK 抑制产生反应。

¹⁴

总之，MEK 抑制剂和 ICI 单一疗法在 iCCA 中没有显示出广泛的疗效。

几项临床试验正在进行中，以研究 MEK 抑制剂和 ICI 在胃肠道癌症（包括胰腺癌和结肠癌）中的疗效。

¹⁵

尽管如此，目前尚无关于在 iCCA 中 MEK 抑制剂和 ICI 联合治疗的数据，但 2 项临床试验正在进行中，将 ICI 和 MEK 抑制剂联合用于不可切除的晚期胆道癌（NCT02586987 和 NCT03201458）。

我们研究了曲美替尼联合抗 PD-1 单克隆抗体治疗小鼠 iCCA 的效果。我们观察到曲美替尼导致肿瘤细胞上主要组织相容性复合体 I (MHC-I) 和程序性细胞死亡配体 1 PD-L1 的上调，当与抗程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 结合时增强淋巴细胞识别. 在皮下和原位模型中，曲美替尼和抗 PD-1 单克隆抗体的组合减小了肿瘤大小并增加了存活时间。通过全外显子组测序，我们展示了 KRAS wt iCCA 小鼠肿瘤细胞系 SB1，其基因类似于在一部分患者中发现的 iCCA。

结果

曲美替尼治疗直接抑制体外和体内肿瘤生长

首先，我们测试了曲美替尼对 2 种可用小鼠 iCCA 细胞系 SB1 和 LD-1 以及人类 iCCA 细胞系 (EGI-1) 生长的体外影响。剂量反应研究显示 EGI-1（图1A，中值抑制浓度 [IC ₅₀ ]，27.89 nmol/L）细胞的生长显着降低。如所预期的，这种生长抑制在SB1（不太明显图1乙，IC ₅₀，41.50纳摩尔/ L）和LD-1（图1 ç，IC ₅₀，56.1纳摩尔/ L）细胞，这是KRASwt，在对比KRAS ^G12D突变的 EGI-1 细胞。同样，我们观察到 EGI-1、SB1 和 LD-1 细胞在 25 nmol/L 曲美替尼治疗 48 小时后肿瘤细胞增殖降低（图 1 D-F）。其他研究人员表明，在没有丝裂原活化蛋白激酶/ERK 通路突变的情况下，曲美替尼也可导致肿瘤生长抑制。

¹⁴

因此，体外结果促使我们研究曲美替尼治疗是否会减少体内 iCCA 肿瘤的生长。皮下注射SB1或LD-1肿瘤细胞，并在肿瘤形成5天后开始曲美替尼治疗。通过每日管饲法用 1 mg/kg 曲美替尼治疗小鼠 15 天，并监测肿瘤生长（图1G）。与体外结果一致，trametinib处理导致显著减少肿瘤生长与控制SB1（比较图1 ħ）和LD-1（图1我）胁腹肿瘤。我们的结果清楚地表明，曲美替尼可以减少 iCCA 肿瘤的生长，即使在体外 KRASwt 细胞系中也是如此。

图 1 Trametinib 在体外和体内降低肿瘤生长。( A ) EGI-1 (n = 8)、( B ) SB1 (n = 8)、( C ) LD-1 (n = 4)和曲美替尼处理48小时的体外肿瘤细胞生长。3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) 测定用于测量细胞活力。使用 xCELLigence RTCA 系统（每组 n = 3 个）使用或不使用 25 nmol/L 曲美替尼处理 48 小时的 ( D ) EGI-1、( E ) SB1 和 ( F ) LD-1 细胞的体外细胞生长. ( G ) 实验装置：C57BL/6 小鼠皮下注射 10 ⁶SB1 或 LD-1 细胞用曲美替尼处理，如每日管饲所示。（H和I）皮下（A）SB1和（B）LD-1肿瘤随时间的体内肿瘤生长。显示了两组：对照（n = 5）与曲美替尼治疗（n = 4）。肿瘤生长显示为以毫米为单位的最大肿瘤直径。数据代表平均值±SD。∗∗ P < .01, ∗∗∗ P < .001, ; 学生t检验。OD，光密度。

曲美替尼治疗上调肿瘤细胞表面的 MHC-I 和 PD-L1

为了进一步研究曲美替尼治疗对肿瘤细胞抗原呈递的潜力，我们用 25 nmol/L 曲美替尼处理 SB1、LD-1 和 EGI-1 24 小时，并通过流式细胞术测量 PD-L1 和 MHC-I 表面表达. 有趣的是，曲美替尼增加了 SB1（图2A -C）和 LD-1（图2D-F）中 PD-L1 和 MHC-I 的表达。在 EGI-1 细胞中，曲美替尼处理增加了 MHC-I，但不增加 PD-L1 的表达（图 2 G-I）。总之，这些结果表明曲美替尼治疗对抗肿瘤免疫具有潜在影响。因此，我们推断使用 ICI 的联合治疗可能会提高曲美替尼的疗效。

图 2 Trametinib 增加了 iCCA 肿瘤细胞系上 MHC-I 的表面表达。用 25 nmol/L 曲美替尼处理 24 小时的 SB1 细胞表面 ( A ) MHC-I 和 ( B ) PD-L1 表达的中值荧光强度 (MFI)通过流式细胞术测量（每组 n = 7）。( C ) 25 nmol/L 曲美替尼（红色）与对照（蓝色）处理 24 小时后，SB1 细胞表面 MHC-I（左部分）和 PD-L1（右部分）表达的代表性直方图。通过流式细胞术测量用 25 nmol/L 曲美替尼处理 24 小时后 LD-1 细胞的表面 ( D ) MHC-I 和 ( E ) PD-L1 表达的MFI（每组 n = 7）。( F) 25 nmol/L 曲美替尼（红色）与对照（蓝色）处理 24 小时后，LD-1 细胞表面 MHC-I（左部分）和 PD-L1（右部分）表达的代表性直方图。通过流式细胞术测量用 25 nmol/L 曲美替尼处理 24 小时的 EGI-1 细胞表面 ( G ) MHC-I 和 ( H ) PDL-1 表达的MFI（每组 n = 7）。( F ) 25 nmol/L 曲美替尼（红色）与对照（蓝色）处理 24 小时后，EGI-1 细胞表面 MHC-I（左部分）和 PD-L1（右部分）表达的代表性直方图。数据代表平均值±SD。∗ P < .05，和 ∗∗∗∗ P < .0001；学生t检验。

抗 PD-1 治疗增强了曲美替尼的抗肿瘤免疫反应

为了研究可能的增效抗肿瘤治疗ICI和trametinib的效果，我们处理的小鼠与SB1和与trametinib和抗PD-1（LD-1胁腹肿瘤图3甲）。使用曲美替尼后皮下 SB1 和 LD-1 的肿瘤大小减小，但抗 PD-1 单药治疗没有减小。联合治疗导致最大的肿瘤生长减少（图3B和D）以及 SB1 和 LD-1 肿瘤重量的终点测量（图3E和F）。联合治疗也提高了 SB1 荷瘤小鼠的存活率，而单药治疗方案未能延长该肿瘤模型的存活率（图3G）。在曲美替尼 + 抗 PD-1 治疗后的 LD-1 荷瘤小鼠中观察到类似的结果（图3H）。

图 3 Trametinib 联合抗 PD-1 可提高皮下 SB1 肿瘤小鼠的存活率。( A ) 实验设置：C57BL/6 小鼠皮下注射 10 ⁶ SB1 或 LD-1 细胞，每天灌胃用曲美替尼处理并接受抗 PD-1（在指定时间点为 200 μg/小鼠）。( B ) 皮下 SB1（左部分，n = 5）和 LD-1（右部分，n = 5）肿瘤的代表性图片。实验装置示于图3甲。皮下 ( C ) SB1 和 ( D ) 的肿瘤生长) LD-1 侧翼肿瘤随着时间的推移。显示了四组：对照（n = 5）与曲美替尼治疗（n = 4）与抗 PD-1（抗 PD-1，n = 5）治疗与组合（曲美替尼 + 抗 PD-1，n = 5）。肿瘤生长显示为以毫米为单位的最大肿瘤直径。皮下 ( E ) SB1 和 ( F ) LD-1 肿瘤的肿瘤重量。实验装置示于图3甲。随着时间的推移，皮下 ( G ) SB1 和 ( H ) LD-1 肿瘤小鼠的存活率（每组 n = 5），对数秩检验。数据代表平均值±SD。∗ P < .05、∗∗ P < .01、∗∗∗ P < .001 和 ∗∗∗∗ P < .0001；学生Ť测试。aPD-1，抗程序性细胞死亡蛋白-1。

到ICCA的更好地模拟临床上，我们注射SB1细胞原位成小鼠肝脏（在所示的实验概要图4甲）。肝内 SB1 肿瘤的 iCCA 表型通过细胞角蛋白 (CK) 19 染色确认（图4B）。原位SB1注射后肿瘤负荷在组合治疗降低与单独trametinib（比较图4 Ç和d）。患有原位 SB1 肿瘤的小鼠的存活率显示，用曲美替尼 + 抗 PD-1 治疗的小鼠的存活率显着提高（图 4 E）。

图 4 Trametinib 联合抗 PD-1 控制原位 iCCA 模型中的肿瘤生长。( A ) 实验设置：C57BL/6 小鼠肝内注射 2 × 10 ⁵ SB1 细胞，每天灌胃用曲美替尼处理并接受抗 PD-1（在指定时间点为 200 μg/小鼠）。( B ) CK19 染色（上部分）和 H&E 染色（下部分）肝内 SB1 肿瘤的代表性图像。比例尺：500 μm。( C ) 肝内 SB1 肿瘤的代表性图片。实验装置示于图4甲。( D) 肝内 SB1 肿瘤的肿瘤重量 (g)。实验装置示于图4甲。( E ) 肝内 SB1 肿瘤小鼠随时间推移的存活率（每组 n = 5），对数秩检验。( F ) 实验设置：C57BL/6 小鼠尾静脉注射 NICD + AKT 质粒注射液，每天灌胃用曲美替尼治疗，并接受抗 PD-1（在指定时间点为 200 μg/小鼠）。( G ) 代表性 H&E 染色的全玻片扫描（左侧部分）使用 HALO Random Forrest Classifier 函数（Indica Labs，Albuquerque，NM）进行图像分析后的鼠类 iCCA 肝脏和组织切片，并显示为数字叠加，指示分类为肿瘤（红色）和剩余正常肝脏（绿色）的区域。比例尺：1 毫米。（ħ）肿瘤肝组织的比例NICD + AKT注射（每组n = 4组）对应于后图4 ˚F。实验装置示于图4甲。( I ) 治疗后小鼠的体重。实验装置示于图4 ë。( I ) 丙氨酸氨基转移酶 (ALT), ( J ) 天冬氨酸氨基转移酶 (AST), ( K) 碱性磷酸酶，和 ( L ) 治疗后血清白蛋白水平。实验装置示于图4甲。数据代表平均值±SD。∗ P < .05，∗∗ P < .01；学生t检验。aPD-1，抗程序性细胞死亡蛋白-1；T，曲美替尼。

接下来，我们使用 AKT + Notch 1 流体动力学质粒注射将我们的研究扩展到主要 iCCA 模型（实验轮廓如图4 F所示）。同样，与抗 PD-1 或曲美替尼的单一治疗相比，抗 PD-1 和曲美替尼的组合显着降低了肝脏肿瘤负担（图 4 G和H）。

鼠标重量；肝酶丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶；和白蛋白血清水平在治疗组之间相等，表明治疗耐受性良好（图 4 I-M ）。总之，我们的结果表明，曲美替尼 + 抗 PD-1 的组合是一种有效的治疗方法，可以减少小鼠各种 iCCA 肿瘤模型的肿瘤负荷。

抗 PD-1 + 曲美替尼的组合促进 T 细胞的激活

分析肝淋巴细胞的免疫特征以阐明曲美替尼+抗PD-1联合治疗增强疗效的潜在机制。在原位SB1荷瘤小鼠的肝脏淋巴细胞，CD44的上调^高CD62L^低效应记忆CD8 ⁺和CD4 ⁺ T细胞（门控策略中所示图5甲）的组合治疗组中被发现（图5乙和C，图 5 D所示的门控策略。CD107 染色显示抗 PD-1 + 曲美替尼治疗后 CD8 ⁺ T 细胞的脱颗粒显着改善。图 5 E和F )。此外，更多的干扰素γ（IFNγ）⁺ CD8 ⁺的组合治疗组中观察到的T细胞与trametinib单剂组（比较图5 ģ和ħ）。为了评估肿瘤特异性细胞毒性，我们在体外用 SB1 细胞刺激了来自携带 SB1 侧腹肿瘤的小鼠的脾细胞。联合治疗增加了 CD107 ⁺ CD4 ⁺ T 细胞的百分比（图 5 I和J）。这些结果表明，联合治疗会释放免疫反应，并在体内产生针对 iCCA 的强大免疫记忆。

图 5曲美替尼 + 抗 PD-1 疗法释放免疫系统对抗 iCCA 肿瘤。( A )治疗后原位 SB1 荷瘤小鼠肝淋巴细胞CD4 ⁺和 CD8 ⁺门控策略的代表性等高线图。实验装置示于图4甲。肝内 SB1 注射后肝 ( B ) CD44^高CD62L^低CD8 ⁺和 ( C ) CD4 ⁺效应记忆 T 细胞的百分比（每组 n = 5）。实验装置示于图4甲。( D)治疗后原位 SB1 荷瘤小鼠肝淋巴细胞的 CD44^高CD62L^低CD8 ⁺效应记忆 T 细胞的代表性等高线图和频率（门控策略 CD3 ⁺ CD8 ⁺）。实验装置示于图4甲。( E )治疗后原位 SB1 荷瘤小鼠肝淋巴细胞CD107 ⁺ CD8 ⁺ T 细胞的百分比和 ( F ) 代表性等高线图和频率（门控策略 CD3 ⁺ CD8 ⁺) 离体刺激 4 小时后（每组 n = 5）。实验装置示于图4甲。（ģ）百分比和（ħ）代表等高线图和IFNγ的频率⁺ CD8 ⁺治疗（门控策略CD3后原位SB1荷瘤小鼠的肝淋巴细胞的T细胞⁺ CD8 ⁺离体刺激后）4小时（N =每组 5 个）。实验装置示于图4甲。( I ) CD107 ⁺ CD4 ^{+ 的}百分比和 ( J ) 代表性等高线图和频率在用 SB1 肿瘤细胞离体刺激 5 小时后，来自携带 SB1 侧腹肿瘤的小鼠的 T 脾细胞（每组 n = 5）。组的建立被示出为在图3甲。数据代表平均值±SD。∗ P < .05，∗∗ P < .01；学生t检验。aPD-1，抗程序性细胞死亡蛋白-1；FSC-A，前向散射区；FSC-H，前向散射高；L/D，生/死；SSC，侧向散射；T，曲美替尼。

SB1 是 KRASwt 并显示出与 iCCA 患者亚群相似的突变特征

为了将我们的发现应用于临床背景并确定哪些 iCCA 患者亚群可能受益于曲美替尼 + 抗 PD-1，我们对 SB1 细胞进行了全外显子组测序 (WES)。发现SB1细胞具有156的体细胞突变，其中不包括KRAS，BRAF，和ERK（图6甲）。最常见的突变基因的基因座是AFG5I1，AKT1，GRIK2，和KMT2C（图6乙）。比较 SB1 中的单碱基替换特征（图 6 C) 使用人类数据，从人类 CCA（癌症基因组图谱 (TCGA)-胆管癌 [CHOL]）数据集得出 5 个共有特征。重要的是，SB1 中的突变特征与共识特征 B 最匹配。SB1 特征和特征 B 都主要以 T>G 突变为特征（图 6 D）。我们应用 Cox 回归模型来评估每个特征对 TCGA-CHOL 中报告的生存时间的影响。特征 B 对生存率有显着影响，并且该特征的贡献增加会增加不良结果的风险（优势比的 95% CI，3.39–462.4）。因此，曲美替尼 + 抗 PD-1 可能是一种有吸引力的治疗选择，特别是对于预后不良和不利突变特征的高风险患者。

图 6 SB1 肿瘤细胞的 WES。（A）来自 SB1 细胞系 WES 的突变数量和类型的总结。( B ) Afg3I1、Grik2、Kmt2C 和 Akt1 的棒棒糖图显示了每个蛋白质的示意图，其中来自 PFAM（蛋白质家族数据库）的蛋白质域以彩色块突出显示。突变的位置用沿着蛋白质长度的针进行注释。( C ) SB1 细胞系的单碱基替换 (SBS) 特征。如面板顶部所示，6 个突变类别中的每一个都根据前后核苷酸的身份分为 16 个类别，如下所示。( D）来自 TCGA-CHOL 的 5 个共识签名（签名 A-E）的 SBS 签名，按行排列。( E ) NMF 等级调查的诊断图。Cophentic 相关性（左上角）用于确定最佳等级（五）。AAA，ATPases 与多种细胞活动相关；ATPase，三磷酸腺苷酶；删除，删除；F/Y，苯丙氨酸/酪氨酸；NMF，非负矩阵分解；PHD，植物同源域；SET、suvar3-9、zeste 和trithorax 增强剂。

讨论

ICI 是一种很有前景的治疗策略，已显示出对多种恶性肿瘤患者的益处。ICI 在肝脏恶性肿瘤患者中的使用仍然具有挑战性，因为 ICI 治疗的有希望的结果在肝细胞癌或 iCCA 中无法重现。

¹⁰

¹⁶

就在最近，由于在比较这种抗 PD-L1 + 抗血管内皮生长因子治疗方案与索拉非尼的 3 期试验中取得了有希望的结果，不可切除的肝细胞癌的一线治疗从索拉非尼改为阿特珠单抗加贝伐珠单抗。

¹⁷

由于存在大量免疫细胞的肝脏的耐受性景观，免疫治疗特别具有挑战性。

¹⁸

因此，对于 iCCA 患者，仍然没有可用的 ICI 疗法，选择有效的联合合作伙伴可能是提高 ICI 疗效的有希望的策略。

为了研究曲美替尼对 iCCA 肿瘤细胞的影响，我们在体外使用了 25 nmol/L 的浓度。与最近使用 100 nmol/L 曲美替尼治疗 Mia-PaCa2 细胞的出版物相比，这是较低的剂量。

¹⁹

该剂量的单一疗法在体外显示出对肿瘤细胞的适度生长抑制。然而，小鼠中的 LD-1 和 SB1 侧腹肿瘤显示对曲美替尼治疗的强烈反应。有趣的是，当停止曲美替尼治疗时，我们观察到肿瘤生长加速，导致单独使用曲美替尼治疗的组没有生存获益。这与最近的一项临床试验一致，该试验表明曲美替尼治疗胆道癌没有提高生存率。

²⁰

我们假设曲美替尼对提高其免疫原性的肿瘤细胞有直接作用。事实上，曲美替尼治疗在体外增加了肿瘤细胞上的 MHC-1 和 PD-L1 表面表达。因此，我们推断添加靶向 PD-1/PD-L1 轴的单克隆抗体可以增强这种疗法。事实上，联合治疗显着提高了携带 SB1 侧腹肿瘤的小鼠的存活率。

曲美替尼长期作用不足的另一种解释可能是曲美替尼对 T 细胞的影响。其他人已经证明曲美替尼对淋巴细胞具有直接的免疫抑制作用。

²¹

在我们的研究中，我们观察到曲美替尼治疗的小鼠的 CD8 T 细胞的脱颗粒和 IFNγ 产生类似的趋势，尽管这没有达到统计显着性。然而，曲美替尼的这种免疫抑制作用在联合治疗组中被逆转。此外，抗 PD-1 + 曲美替尼增加了效应记忆 T 细胞的百分比，并改善了体外 SB1 荷瘤小鼠CD4 ⁺ T 细胞对 SB1 肿瘤细胞的重新识别。我们的结果表明，抗 PD-1 + 曲美替尼的组合可释放免疫系统，并代表了 iCCA 患者的潜在治疗方法。

ICI 治疗实体瘤的客观反应率约为 15%–20%，

²²

²³

但可以在精心挑选的患者中提供长期消退。因此，我们对 SB1 肿瘤细胞进行了 WES，以显示该细胞系与 iCCA 患者亚群的突变相似性。事实上，与 SB1 细胞相比，我们能够识别出具有相似突变模式的亚群。该亚群的特点是生存率低。此外，WES 显示 SB1 细胞没有发生KRAS、BRAF和ERK突变。这项研究的局限性在于我们没有使用 KRAS ^mut iCCA 细胞系来展示这种疗法对 KRAS ^mut iCCA 患者的特定益处。据我们所知，没有 KRAS ^mut提供 iCCA 细胞系。然而，我们相信我们的结果显示了对 iCCA 患者的有希望的治疗，尤其是与 SB1 细胞具有相似突变模式的患者。

方法

小鼠品系、试剂和细胞系

C57BL/6 小鼠购自 Charles River 实验室，并在 8-12 周龄时用于实验。所有实验均根据当地机构指南进行，并经美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会 (Bethesda, MD) 批准。Trametinib (Melkinist; Novartis, Basel, Swizerland) 从美国国立卫生研究院临床中心药房获得。鼠 CCA 细胞系 SB1

²⁴

和 LD-1，以及人 CAA 细胞系 EGI-1，

²⁵

本研究中使用。LD-1

²⁶

是在我们的实验室建立的，是从小鼠体内注射 AKT 和 YAP 质粒后衍生而来的。LD-1 和 SB1 的 WES 数据将根据要求提供。

动物研究

在 8 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠中进行皮下注射。SB-1 (1 × 10 ⁶) 重悬在 100 μL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，并将肿瘤细胞悬液注射到侧腹中。所有小鼠在治疗开始前随机分组。然后在注射后 5 天，在第 7 天、第 10 天用载体对照（盐水）、每日灌胃 1 mg/kg 曲美替尼或 200 μg 抗 PD-1（克隆 29F.1A12；BioXCell，黎巴嫩，NH）对小鼠进行治疗, 和 15. 一组接受曲美替尼和抗 PD-1 的联合治疗。用卡尺测量肿瘤大小，并在注射肿瘤细胞后第 20 天处死小鼠。对于皮下存活实验，当肿瘤大小达到 20 mm 或肿瘤坏死超过肿瘤表面的 50% 时处死小鼠。iCCA 是通过注入 2 × 10 ⁵ SB1 细胞在 20 μL 的 50:50 PBS 和 Matrigel（康宁，康宁，纽约）溶液中加入左肝叶，如前所述。

²⁷

SB1 肿瘤的 CK19 染色证实了 CCA 表型（图4B）。小鼠的处理如前所述。对于 Notch 胞内结构域 1 (NICD) + AKT iCCA，将 20 μg NICD、4 μg AKT 和 1 μg 多动睡美人 2 转座酶质粒稀释到 1.6 mL PBS 中，并在 5-7 秒内注入尾静脉。

²⁸

注射后 5 周开始治疗，如载体对照（生理盐水）、每日灌胃 1 mg/kg 曲美替尼或 200 μg 抗 PD-1（第 37、40 和 45 天），以及抗 PD 的组合-1 和曲美替尼。注射后第50天处死小鼠。使用 Aperio AT2 数字全玻片扫描仪（Leica Biosystems，Wetzlar，德国）以 20 倍物镜放大率扫描 H&E 染色切片。使用 HALO 图像分析软件 (Indica Labs, Albuquerque, NM) 使用肿瘤区域和正常肝组织区域的模式识别图像分析进行自动量化。

SB1 WES

从10 ⁶ SB1肿瘤细胞中提取DNA 。使用安捷伦（加利福尼亚州圣克拉拉）SureSelect XT Mouse All Exon 和双端测序模式在 NextSeq（Illumina, San Diego, CA）上合并和测序两个外显子组样本。在使用 BWA 映射软件（Illumina），版本 0.7.15）与小鼠 mm10 参考基因组比对之前，使用 Trimmomatic 软件（Usadellab，Aachen，Germany，版本 0.33）修剪接头和低质量碱基的读数。

²⁹

然后使用 Picard 工具（Broad Institute，Cambridge，MA）对映射读数进行去重复，然后使用 Genome Analysis Toolkit（Broad Institute）3.8.0 版重新对齐和基础质量分数重新校准。

³⁰

测序运行产生了 6170 万个总读数，>99% 映射到参考基因组，平均外显子组覆盖率为 69 倍。SB1 的测序数据上传为序列读取存档 (SRA) 提交 SRR13091994，BioProject 登录号 PRJNA679801。

体细胞变异分析

根据基因组分析工具包作者提供的外显子组-seq 分析最佳实践指南，使用基因组分析工具包版本 3.8.0 中的 Mutect2 在仅肿瘤模式下执行体细胞变异调用。

³¹

变体经过质量硬过滤，使用 Ensembl 的 Variant Effect Predictor 版本 95（Ensemble，Hinxton，UK）用功能和后果预测进行注释，

³²

并使用 vcf2maf 工具版本 1.6.16（纪念斯隆凯特琳，纽约，纽约）转换为 Mutation Annotation 格式。

³³

进一步过滤变体以排除外显子组数据中频繁突变的基因。

³⁴

常见的单核苷酸多态性和插入缺失——在 ExAC（Broad 研究所）、gnomAD（Broad 研究所）或 1000 Genomes（欧洲生物信息学研究所，英国欣克斯顿）数据库中注释的频率大于 0.01——也被删除。此外，SB1 细胞系数据中小于 20 倍深度和替代等位基因频率小于 5% 的变体被删除。

突变特征分析

Mutect2 为 TCGA-CHOL 数据集调用的变体使用 R（维也纳，奥地利）包 TCGABiolinks 作为 Mutation Annotation Format 文件进行检索

³⁵

（版本 2.12.6）。对于每个变异位点，从基因组序列中提取相邻的 5' 和 3' 碱基以使用 Maftools 生成三核苷酸替换频率

³⁶

（版本 2.0.16）。该矩阵用于使用 NMF 包计算所有 50 个 TCGA-CHOL 样本的共识签名

³⁷

（版本 0.23.0）。如 Brunet 等人所述，通过比较 3 到 10 个签名的共表相关性来优化签名的数量，

³⁸

并且选择了 5 个签名作为最佳签名数（图 6 E）。使用 MutationalPatterns（Bioconductor, Fred Hutchinson Cancer Research Cener, Seattle, WA）计算这 5 个特征（特征 A-E）在每个样本的个体特征中的贡献

³⁹

（版本 1.10.0）。

生存分析

使用 TCGABiolinks（Bioconductor，Fred Hutchinson Cancer Research Cener）检索 TCGA-CHOL 提供的临床数据。进行 Cox 比例风险回归建模以独立模拟每个特征贡献的影响，控制患者年龄和性别作为协变量。使用生存 R 包进行建模

⁴⁰

（版本 3.2-7），并使用 survminer 进行可视化

⁴¹

（版本 0.4.8）。

体外肿瘤细胞活力测定、增殖测定和抗原分析

用曲美替尼在 200 μL 培养基（RPMI、10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素）中处理每孔总共 5000–10,000 个 SB1、LD-1 和 EGI-1 细胞 48 小时。使用 MTT 细胞增殖试剂盒（ab211091；Abcam，Cambridge，UK）测量细胞活力。还根据制造商的说明使用 xCELLigence RTCA 系统（安捷伦）分析细胞增殖。将总共 5000–10,000 个 SB1、LD-1 和 EGI-1 细胞接种在 16X E-Pate（00 300 600 890；安捷伦）中，并用 200 nmol/L 曲美替尼处理 48 小时。对于 MHC-I 和 PD-L1 表面染色，3 × 10 ⁵细胞/孔用 200 nmol/L 曲美替尼处理 24 小时，并使用流式细胞术分析细胞。

CD107 脱粒试验

SB1 细胞在 96 孔平底板中过夜（2 × 10 ⁴细胞/孔）接种。第二天，杀死携带 SB1 胁腹肿瘤的小鼠并分离脾细胞。与SB1细胞共培养10 ^{6 个}脾细胞/孔，孵育5小时，然后洗涤染色。分析淋巴细胞上的 CD107 表达以确定肿瘤特异性脱颗粒。

流式细胞术

对于表面标记染色，细胞在室温下用抗体染色 15 分钟。对于离体激活，细胞用刺激混合物（51-2042E；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）刺激，同时用荧光染料偶联的抗 CD107a 抗体染色。通过使用活/死细胞染色试剂盒（ThermoFisher science，Waltham，MA）排除死细胞。以下抗体用于流式细胞术分析：抗 CD3-亮紫 (BV) 605（克隆 17A2；Biolegend，San Diego，CA）、CD8-Alexa Fluor 700（克隆 53-6.7；Biolegend）、抗 CD8- Pacific Blue (PB)（克隆 53-6.7；Biolegend），抗 CD44-藻红蛋白（PE）/Cy7（克隆 1M7；Biolegend），抗 CD62L PerCP/Cy5（克隆 MEL-14；Biolegend），抗 CD4- Alexa Fluor 700（克隆 GK1.5；Biolegend），抗干扰素γ-别藻蓝蛋白（APC）（克隆 XMG1.2；Biolegend），

统计分析

对于所有模型，进行动物随机化和检查者盲法。使用 GraphPad Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA) 进行统计分析。通过Student非配对t检验计算组间差异的显着性。P < .05 被认为具有统计学意义。

CRediT 作者贡献

Simon Wabitsch，医学博士（概念化：平等；形式分析：铅；调查：铅；写作——原稿：铅）

Mayank Tandon（正式分析：支持；写作——原稿：支持；写作——审查和编辑：支持）

Benjamin Ruf, MD（概念化：支持；写作——评论和编辑：支持）

张千飞，博士（调查：支持；写作-审查和编辑：支持）

Justin D McCallen，BS（调查：支持；写作——评论和编辑：支持）

John C McVey，文学士（调查：支持；写作——评论和编辑：支持）

Chi Ma, MD PhD（概念化：支持；写作——原稿：平等）

Benjamin Green, MD（验证：支持；写作——评论和编辑：支持）

Laurence P Diggs, MD（概念化：支持；验证：支持；写作——评论和编辑：支持）

Bernd Heinrich, MD（概念化：支持；写作——评论和编辑：支持）

Tim F Greten，医学博士（概念化：平等；监督：领导；写作——评论和编辑：平等）

致谢

作者要感谢乔纳森·埃尔南德斯博士提供 EGI-1 细胞系。图形摘要是使用BioRender.com创建的。

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Publication History

Published online: May 21, 2021

Accepted: May 15, 2021

Received: January 17, 2021

Publication stage

In Press Journal Pre-Proof

Footnotes

Conflicts of interest The authors disclose no conflicts.

Funding Supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft grant WA-4610/1-1 (S.W.), and by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health , National Cancer Institute (ZIA BC 011345, ZO1 BC010870) (T.F.G.).

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DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2021.05.011

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Figures

Graphical Abstract
Figure 1Trametinib decreases tumor growth in vitro and in vivo. In vitro tumor cell growth of (A) EGI-1 (n = 8), (B) SB1 (n = 8), (C) LD-1 (n = 4), and with trametinib treatment for 48 hours. The 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay was used to measure cell viability. In vitro cell growth of (D) EGI-1, (E) SB1, and (F) LD-1 cells treated with or without 25 nmol/L trametinib treatment for 48 hours using the xCELLigence RTCA system (n = 3 per group). (G) Experimental set-up: C57BL/6 mice with subcutaneous injection of 10⁶ SB1 or LD-1 cells treated with trametinib as indicated by daily gavage. (H and I) In vivo tumor growth of subcutaneous (A) SB1 and (B) LD-1 tumors over time. Two groups are shown: control (n = 5) vs trametinib treatment (n = 4). Tumor growth is shown as the largest tumor diameter in millimeters. Data represent means ± SD. ∗∗P < .01, ∗∗∗P < .001, ; Student t test. OD, optical density.
Figure 2Trametinib increases surface expression of MHC-I on iCCA tumor cell lines. Median fluorescence intensity (MFI) of surface (A) MHC-I and (B) PD-L1 expression of SB1 cells treated with 25 nmol/L trametinib for 24 hours measured by flow cytometry (n = 7 per group). (C) Representative histogram plots of surface MHC-I (left section) and PD-L1 (right section) expression on SB1 cells after 25 nmol/L trametinib (red) treatment vs control (blue) for 24 hours. MFI of surface (D) MHC-I and (E) PD-L1 expression of LD-1 cells treated with 25 nmol/L trametinib for 24 hours measured by flow cytometry (n = 7 per group). (F) Representative histogram plots of surface MHC-I (left section) and PD-L1 (right section) expression on LD-1 cells after 25 nmol/L trametinib (red) treatment vs control (blue) for 24 hours. MFI of surface (G) MHC-I and (H) PDL-1 expression of EGI-1 cells treated with 25 nmol/L trametinib for 24 hours measured by flow cytometry (n = 7 per group). (F) Representative histogram plots of surface MHC-I (left section) and PD-L1 (right section) expression on EGI-1 cells after 25 nmol/L trametinib (red) treatment vs control (blue) for 24 hours. Data represent means ± SD. ∗P < .05, and ∗∗∗∗P < .0001; Student t test.
Figure 3Trametinib in combination with anti–PD-1 improves survival of mice with subcutaneous SB1 tumors. (A) Experimental set-up: C57BL/6 mice with a subcutaneous injection of 10⁶ SB1 or LD-1 cells treated with trametinib by daily gavage and received anti–PD-1 (200 μg/mouse at indicated time points). (B) Representative pictures of subcutaneous SB1 (left section, n = 5) and LD-1 (right section, n = 5) tumors. Experimental set-up is shown in Figure 3A. Tumor growth of subcutaneous (C) SB1 and (D) LD-1 flank tumors over time. Four groups are shown: control (n = 5) vs trametinib treatment (n = 4) vs anti–PD-1 (anti–PD-1, n = 5) treatment vs combination (Trametinib + anti–PD-1, n = 5). Tumor growth is shown as the largest tumor diameter in millimeters. Tumor weights of subcutaneous (E) SB1 and (F) LD-1 tumors. Experimental set-up is shown in Figure 3A. Survival of mice with subcutaneous (G) SB1 and (H) LD-1 tumors over time (n = 5 per group), log-rank test. Data represent means ± SD. ∗P < .05, ∗∗P < .01, ∗∗∗P < .001, and ∗∗∗∗P < .0001; Student t test. aPD-1, anti-Programmed cell death protein-1.
Figure 4Trametinib in combination with anti–PD-1 controls tumor growth in orthotopic iCCA models. (A) Experimental set-up: C57BL/6 mice with intrahepatic injection of 2 × 10⁵ SB1 cells treated with trametinib by daily gavage and received anti–PD-1 (200 μg/mouse at the indicated time points). (B) Representative images of CK19 staining (upper section) and H&E staining (lower section) of intrahepatic SB1 tumors. Scale bar: 500 μm. (C) Representative pictures of intrahepatic SB1 tumors. Experimental set-up is shown in Figure 4A. (D) Tumor weights (g) of intrahepatic SB1 tumors. Experimental set-up is shown in Figure 4A. (E) Survival of mice with intrahepatic SB1 tumors over time (n = 5 per group), log-rank test. (F) Experimental set-up: C57BL/6 mice with hydrodynamic tail vein injection of NICD + AKT plasmid injection treated with trametinib by daily gavage and received anti–PD-1 (200 μg/mouse at the indicated time points). (G) Whole slide scan of a representative H&E stain (sections on the left) of a murine iCCA-bearing liver and tissue section after image analysis using HALO Random Forrest Classifier function (Indica Labs, Albuquerque, NM) and shown as a digital overlay indicating areas classified as tumor (red) and remaining normal liver (green). Scale bar: 1 mm. (H) Tumor to liver tissue ratio after NICD + AKT injection (n = 4 per group) corresponding to Figure 4F. Experimental set-up is shown in Figure 4A. (I) Weight of mice after treatment. Experimental set-up is shown in Figure 4E. (I) Alanine aminotransferase (ALT), (J) aspartate aminotransferase (AST), (K) alkaline phosphatase, and (L) albumin serum levels after treatment. Experimental set-up is shown in Figure 4A. Data represent means ± SD. ∗P < .05, ∗∗P < .01; Student t test. aPD-1, anti-Programmed cell death protein-1; T, trametinib.
Figure 5Trametinib + anti–PD-1 therapy unleashes the immune system against iCCA tumors. (A) Representative contour plot of CD4⁺ and CD8⁺ gating strategy of hepatic lymphocytes of orthotopic SB1 tumor-bearing mice after treatment. Experimental set-up is shown in Figure 4A. Percentage of hepatic (B) CD44^highCD62L^low CD8⁺ and (C) CD4⁺ effector memory T cells after intrahepatic SB1 injection (n = 5 per group). Experimental set-up is shown in Figure 4A. (D) Representative contour plot and frequencies of CD44^highCD62L^low CD8⁺ effector memory T cells of hepatic lymphocytes of orthotopic SB1 tumor-bearing mice after treatment (gating strategy CD3⁺CD8⁺). Experimental set-up is shown in Figure 4A. (E) Percentage and (F) representative contour plot and frequencies of CD107⁺CD8⁺ T cells of hepatic lymphocytes of orthotopic SB1 tumor-bearing mice after treatment (gating strategy CD3⁺CD8⁺) after ex vivo stimulation for 4 hours (n = 5 per group). Experimental set-up is shown in Figure 4A. (G) Percentage and (H) representative contour plot and frequencies of IFNγ⁺CD8⁺ T cells of hepatic lymphocytes of orthotopic SB1 tumor-bearing mice after treatment (gating strategy CD3⁺CD8⁺) after ex vivo stimulation for 4 hours (n = 5 per group). Experimental set-up is shown in Figure 4A. (I) Percentage and (J) representative contour plot and frequencies of CD107⁺CD4⁺ T splenocytes from SB1 flank-tumor-bearing mice after ex vivo stimulation with SB1 tumor cells for 5 hours (n = 5 per group). Group set-up is shown as in Figure 3A. Data represent means ± SD. ∗P < .05, ∗∗P < .01; Student t test. aPD-1, anti-Programmed cell death protein-1; FSC-A, forward scatter area; FSC-H, forward scatter high; L/D, live/dead; SSC,side scatter; T, trametinib.
Figure 6WES of SB1 tumor cells. (A) Summary of mutation number and type from WES of the SB1 cell line. (B) Lollipop plots for Afg3I1, Grik2, Kmt2C, and Akt1 showing a schematic of each protein with protein domains from PFAM (protein family database) highlighted in colored blocks. Location of mutations is annotated with pins along the length of the protein. (C) Single-base substitution (SBS) signature of SB1 cell line. Each of the 6 mutation classes, as indicated at the top of the panel, is separated into 16 categories based on the identity of the preceding and following nucleotide as shown below. (D) SBS signatures for the 5 consensus signatures (Signature A–E) derived from TCGA-CHOL, arranged in rows. (E) Diagnostic plots for NMF rank survey. Cophentic correlation (top-left) was used to determine the optimal rank (five). AAA, ATPases associated woth diverse cellular activities; ATPase, adenosine triphosphatase; Del, deletion; F/Y, phenylalanin/tyrosine; NMF, non-negative matrix factorisation; PHD, plant homeodomain; SET, suvar3-9, enhancer-of-zeste and trithorax.

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