质谱专题|质谱检测在维生素项目中的应用现状

文章内容整理自 北京和合医学诊断技术股份有限公司 倪君君 教授的专题报告

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维生素分为脂溶系列包括A、D、E、K和水溶系列维生素B族及维生素C。维生素检测临床应用主要分为三大方向，即维生素缺乏或者过量相关疾病检测；作为个体化营养或治疗监测的科学依据以及孕妇、老年人、儿童或慢性病患者等特殊人群维生素科学补充依据 。目前对维生素D、B6、B9及B12开发了传统的免疫学的检测方法，但免疫法无法区分亚型比如维生素D2及D3以及在婴儿中含量较高的Epi同分异构体，因此免疫学方法检测经常会出现假阳性或假阴性。相比之下，质谱法具有准确度高、特异性强、灵敏度高、分析速度快、稳定性高和通量高等特点，已成为小分子物质（包括目标物及其代谢产物）精准定量分析的首选方法，在维生素测定领域被视为金标准，是唯一能够准确区分维生素D2与D3亚型的检测方法，同时也具有高通量的特点，一次采血可实现多指标的同时检测。

脂溶性维生素与水溶性维生素

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脂溶性维生素

脂溶性维生素是不溶于水而溶于脂肪及非极性有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等)的一类维生素，包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等。这类维生素一般只含有碳、氢、氧三种元素，在食物中多与脂质共存，其在机体内的吸收通常与肠道中的脂质密切相关，可随脂质吸收进人人体并在体内储存(主要在肝脏) ，排泄率不高；摄人量过多易引起中毒现象，若摄入量过少则缓慢出现缺乏症状。有些患者因体内缺少维生素转化相应酶等原因食物补充时间长且效果慢。

维生素A的生理功能主要是维持视觉功能、参与上皮组织糖蛋白的合成，促进生长与生殖，维持和促进免疫功能，参与铁代谢。缺乏时表现为生长迟缓、暗适应能力减退而形成夜盲症。由于表皮和粘膜上皮细胞干燥、脱屑、过度角化、泪腺分泌减少，从而发生干眼病，重者角膜软化、穿孔而失明。呼吸道上皮细胞角化并失去纤毛，使抵抗力降低易于感染。维生素A过量一般会出现神经系统或者骨骼肌肉系统损害，初期表现为生理损害，慢慢会发展成一种疾病的损害，如果过量严重会发生急性中毒出现恶心呕吐头晕，值得注意的是维生素A急性中毒危险性较高。在临床检测中，维生素A以视黄醇为检测指标。

维生素E的生理功能主要分为抗氧化、清除自由基和免疫调节等三个方面。维生素E缺乏会导致不孕症，过量时候会出现眩晕、头痛或皮肤类症状，摄入过多时肝脏蓄积而会发生急性中毒，不易被代谢掉。维生素E以α-生育酚为检测指标。

维生素D一般在体内有代谢过程，在肝脏中会代谢成25羟基的单羟基维生素D。其生理功能包括各个系统免疫调节、肾小管对钙磷重吸收，主要对促进肠钙吸收有重要作用。近年来研究发现维生素D与多种慢性疾病发展非常相关。缺乏时，临床表现为小儿佝偻病，成人软骨症等，目前部分肿瘤科或慢性疾病科也进行维生素D检测。维生素D过量时会出现早期中毒和晚期中毒现象。维生素D检测较为复杂，常见检测指标为25-OH-D2、25-OH-D3。

维生素K又叫凝血维生素，属于维生素的一种，具有叶绿醌生物活性。维生素K包括K1、K2、K3、K4等几种形式，其中K1、K2是天然存在的，属于脂溶性维生素；而K3、K4是通过人工合成的，是水溶性的维生素。四种维生素K的化学性质都较稳定，能耐酸、耐热，正常烹调中只有很少损失，但对光敏感，也易被碱和紫外线分解。维生素K具有防止新生婴儿出血疾病、 预防内出血及痔疮、 减少生理期大量出血、促进血液正常凝固等生理作用，故而在临床中有一定应用，也是近年来在临床上新兴的维生素检测项目，以VK1和VK2为主要检测项目。VK1主要与凝血因子、蛋白质因子等某些酶的辅酶非常相关，与凝血的关系更紧密。VK2主要功能为促进骨钙化形成，因此与骨代谢、血管钙化类疾病有较大相关性，VK2目前应用比较多的检测指标为MK4和MK7。

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水溶性维生素

水溶性维生素是可溶于水而不溶于非极性有机溶剂的一类维生素，包括维生素B族和维生素C。这类维生素除碳、氢氧元素外，有的还含有氮硫等元素。与脂溶性维生素不同，水溶性维生素在人体内储存较少，从肠道吸收后进入人体的多余的水溶性维生素大多从尿中排出。水溶性维生素几乎无毒性，摄入量偏高一般不会引起中毒现象，若摄入量过少则较快出现缺乏症状。由于不易蓄积、结构复杂与不稳定性，临床上常难以检测。

维生素B族的一般的生理功能通常与各类糖代谢、脂类代谢、氨基酸代谢等重要人体基础代谢较为相关，同时，维生素B族也是维持神经功能的基础物质。因此， B族维生素缺乏或者过量时候常会出现脚气病、皮炎、皮肤开裂等皮肤性疾病或神经性四肢神经疼痛、脚趾麻木等神经类疾病。由于维生素B6生理功能更加全面几乎参与所有体内生理代谢功能且过量会出现神经病变、共济失调，运动性失控等明显临床表现，因此目前在临床中监测较多。维生素B9即叶酸，该指标有着较多的临床应用，特别是孕妇怀孕期间需服用叶酸，因此临床上对于B9监测近几年受到广泛重视。随着生活水平提高，人们倾向服用保健品补充维生素，维生素C检测逐年增加。实际上，长期大剂量服用维生素，一旦停药会出现维生素C缺乏综合症，因此近年来该项目检测呈递增趋势。

维生素检测方法

当前，维生素检测方法主要集中在两种手段，分别为免疫类与色谱质谱类。免疫类方法以自动化为优势，一次可检测大批量样本且操作简单。然而，免疫类方法检测指标较少，无法检测多种目标物。色谱质谱灵敏度、准确度较好，但仪器昂贵且前处理方式复杂，特别是维生素类项目，由于稳定性差因此前处理过程更为复杂。

质谱技术在维生素检测中的优势

质谱技术在维生素检测中发挥了巨大优势，具体表现为特异性、灵敏度、准确度、多个指标同时监测等多个方面。

在特异性方面

由于每个目标物之间差异较小，有些为同分异构体，其他技术很难达到精准分离，因此想要精准检测某一目标物，需用到质谱检测中的特异性优势。目前，色谱质谱的串联技术可以进行较好的目标物分离及多通道监测。以目前临床应用较多的维生素D为例，采用MRM监测手段可同时测定但羟基、多羟基VD2和VD3，通过色谱分离消除同分异构体3-epi-OH-VD3的干扰，质谱特异性检测可精准检测目标物。

在灵敏度方面

如果检测方法达不到精准度，则检测限很难满足临床需要。质谱的灵敏度较高，可达到ppt、ppb级别。例如，1,25--(OH)2-D3最低检测限可达到3pg/mL左右，有的实验室甚至可达到更低，完全符合临床生物参考区间要求。目前，临床应用趋势为床旁检测或微量化检测，尽可能利用一滴血、一张纸片进行多指标检测，因此采血量要求越少越好，对检测方法的灵敏度要求较高。

在准确度方面

用质谱与化学发光两种方法测定血清中叶酸与5-甲基四氢叶酸为例。低浓度时质谱法比化学发光低，高浓度时比化学发光法测定值高，但中浓度时两个方法差别不大。可见，从方法学角度，两个方法在准确度方面有一定差异。对比质谱法检测叶酸，化学发光法特别是在低浓度与高浓度时准确度有一定问题。

在多指标同时监测方面

在实验室临床中进行维生素检测非常受益。目前，临床多需要利用一滴血检测多种维生素。利用质谱检测，可省去多次采血、采血量较大、成本高的问题。利用质谱检测，同时可进行6种脂溶性维生素或者是11种水溶性维生素并在6-7分钟内进行分离，大大缩短分析时间，节省患者检测成本。

质谱技术在维生素检测中的挑战

在临床应用中，国内细分人群参考区间建立，对于质谱检测维生素项目推广价值较大。目前维生素检测参考区间多数参考国外人群，国内缺乏不同地区、不同人群与不同年龄段参考区间。若运用其他方法学或国外人群参考区间，对临床认知会出现一定偏差。另一方面，对于第三方实验室，样本稳定性也是重要问题之一。第三方实验室的样本多数来源于医院，由于维生素本身具有不稳定性，对于光照、温度与储藏条件均有一定要求，若间隔时间过长或经长途运输会对稳定性产生较大影响。目前，亟需建立实验室稳定性数据与存储一致标准。

除此之外，收费标准也成为检验项目所面临的的最实际问题之一。目前，不同地区、不同城市维生素检测费用差异较大，各省市实验室质谱推广程度不同，收费依据也各不相同。有些根据免疫学方法立项，有些根据目标物收费。无法统一的标准成为各医院开展质谱检测项目的阻碍之一。除了收费无法统一之外，标准化也是维生素质谱检测挑战，其中包括标准品、质控品以及检测试剂盒等耗材类商品化标准化等因素。标准品与质控品目前缺少权威机构统一生产，各医疗机构购买渠道不同，导致标准品质量、可溯源性无法保证。目前国内商品化试剂盒质量参差不齐且以一类试剂盒居多，对刚组建实验室的实验人员来说是一项挑战，需要耗费大量的时间和精力进行考察。而对于检测过程中所必需的耗材，批间差对于灵敏度较高的质谱来说影响较大，如何统一质量成为重点之一。另外，维生素临床监测的认知统一、集中化检测等问题也是质谱在维生素检测应用中所面临的众多挑战。

根据美国临床实验室协会的数据，美国临床实验室每年对患者血液、尿液和其它样品检测次数超过70亿次。在美国，临床质谱技术已经发展得相对成熟，服务于临床检测的项目已达400余项，中国质谱在临床实验室应用方面还有较大的发展空间。国内质谱检测所面临的挑战源于多方面，如何建立统一标准解决临床应用中面临的实际问题，需要医院、专家多中心联合合作，提高我国临床质谱学者在应用和研究方面的水平，并为扩大中国临床质谱在世界范围的影响力打下坚实的基础。