生物分析是指利用色谱法、色谱-质谱联用法、配体结合法等技术对生物基质中的目标物进行定量分析。生物分析包括对基质中药物、代谢产物、蛋白质、多肽等大小分子的分析。在制药行业中，生物分析已被广泛应用于药物发现和药物研发过程中，如药代动力学、毒代动力学、一致性评价、生物利用度、药效动力学等。在许多非制药的研究领域也有广泛的应用，如法医学分析、兴奋剂控制和鉴定、用于疾病诊断的生物标志物定性和定量分析等。
生物分析的对象为生物基质或生物样本，通常包括：血清、血浆、皮肤、血液、尿液、唾液、泪液、脑脊液和其他器官组织等，其特殊性表现在以下几个方面：
生物分析是一套涉及样品收集与储存、处理、进样分析、数据分析及报告等多步骤的流程，如图1所示。生物样本通常需进行前处理才可进行分析，生物样本常用的前处理方法包括：液液萃取法（Liquid-Liquid Extraction）、固相萃取法（hase Extraction）以及沉淀蛋白法（Protein Precipitation）。常见的分析方法为：色谱法（Chromatographic Assays , CC）和配体结合法（Ligand Binding Assays, LBA）。正是由于生物基质的特性以及生物分析过程复杂性，故要求生物分析方法必须确保在一段时间内产生可靠和可重复的结果，而生物分析方法验证（Bioanalytical Method Validation， BMV）则有助于获得可靠的结果，这对于正确决定药物剂量和患者安全性是非常必要的。虽然制药行业对生物分析在药物研发领域发挥的重要作用不可否认，但在1990年之前，对生物分析方法的发展和验证的关注程度较低，在世界范围内无相关的生物分析的行业标准，这就造成递交至药品监管和审批部门的生物样本分析相关资料参差不齐。直到1990年，这一领域才有了重大进展。1990年，由美国药学会（American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS）、食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）、国际制药联合会（International Pharmaceutical Federation，FIP）、加拿大健康保护处( Health Protection Branch，HPB）、分析化学家协会（ Association of Analytical Chemists，AOAC）共同主办、在水晶城召开第一届生物分析方法验证研讨会（The first Bioanalytical Method Validation Workshop）开启了生物分析方法的规范化“之门”。经过对1990 年至1999年之间经验的整理及 2000 年对生物分析方法验证指导原则草案的讨论，FDA在2001年首次颁布实施生物分析方法验证指导原则，这一指导原则的颁布和实施对生物分析领域的规范化具有划时代的指导意义。在2001年FDA在颁布实施生物分析方法验证指导原则之后，世界其他各国也开始建立适合本国的生物分析方法验证指导原则。欧洲药品管理局（EMA） 于2012 年2 月1 日正式发布生物分析指导原则且至今有效。2013年，日本厚生劳动省（MHLW）参考了FDA和EMA指导原则以及AAPS的工作报告，制定并颁布了日本境内的制药行业中的BMV的指导原则并延用至今；中国于2015年在《中国药典》（2015版, ChP）中正式颁布了《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》并延用至今。FDA在2001年颁布了第一版本的BMV指导原则后于2013年又发布了草案版本，用于征求工业界的对于BMV的意见，后于2018年5月份正式发布了定稿版本的《Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry》并延用至今。世界范围内建立相应的BMV指导原则时间如表1所示。虽然自2001年以后，各国都在建立或考虑建立相应的BMV指导原则，但从2009开始，业界对BMV “担忧”也逐渐显现并持续至今，担忧主要涉及两个方面，一是个人或地区对BMV指导原则的解读或理解存在差异；再则生物分析方法应用于不同地区时，对指导原则理解上的细微差别将给行业带来风险。为了消除以上担忧，行业表达了对生物分析方法验证指导原则统一的强烈愿望。为此，在全球生物分析联盟（GBC）、AAPS、MHLW、日本生物分析论坛(JBF)、欧洲生物分析论坛(EBF)、欧洲制药工业协会联合会（European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations， EFPIA）以及ICH等多个机构多年的共同努力下，ICH于2019年02月26日发布了生物分析方法验证指导原则《BIOANALYTICAL METHOD VALIDATION》的Draft版（以下简称M10）。针对M10的发布，多国均公开征求各方意见，各成员要求BMV消除理解差异以及区域差异以及寻求统一的迫切心情可见一斑, M10草案发布为生物分析方法验证的统一带来了一缕曙光。截止2020年4月，美国、欧盟、中国、日本，韩国、加拿大、巴西等均发布适合本区域内或者本组织的BMV指导原则。这些生物分析指导原则中主体内容基本相似，但也并非完全相同，个别验证参数上也存在一定差异。本文将对在世界范围影响力深远且有代表意义的FDA、 EMA、ICH发布的BMV的指导原则以及对我国的生物分析领域具有明确指导意义BMV的指导原则进行深度的比较和解读，包括：指导原则的适用范围、方法开发要求、验证类型、色谱法验证参数和接受标准、配体结合法验证参数和接受标准、已测样品再分析（ISR）、内源性物质的检测要求。了解BMV指导原则的适用范围对于药物注册申报非常必要，比较以上指导原则的适用范围可以发现：以上指导原则均适用于采用色谱法和配体结合分析法进行的药物以及代谢物定量结果分析，但是对于生物标志物的态度则不同，M10明确表明不适用于生物标志物和免疫原性分析，该范围与EMA于2012年发布的《 Guideline on bioanalytical method validation》（下文简称: EMA/BMV/2012）以及中国药典2015版本中的《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》（下文简称: ChP/9012/2015）一致，而FDA于2018年5月发布的《Bioanalytical Method validation Guidance for Industry》（下文简称: FDA/BMV/2018）适用范围比M10略广，除了适用药物以及代谢物的定量结果分析外，还适用于非临床的生物标志物的评估，从而也可以解读出以上机构对于生物标志物分析的均采取非常慎重的态度，主要原因是生物标志物在评价新型治疗产品或者药物的安全性、活性或有效性方面发挥着举足轻重的作用，因此必需要确保生物标志物的分析方法产生数据的完整性和科学性。FDA在本指导原则中也表达了对于生物标志物检测的建议，评估药物研发过程中的生物标志物分析方法验证的适当程度时，应使用目的适用性评估的概念（The fit-for-purpose ，FFP），即分析方法验证的程度应该与研究的既定目的相适应和匹配。对于方法开发部分，而EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015未做特别说明， M10与FDA/BMV/2018要求基本相同：对开发的过程、关注的指标以及记录进行了简单要求，强调了方法开发的过程，同时也接受比较开放的方式，即：方法开发过程中如何记录、审查、归档以及报告由生物分析实验室自行决定，因为良好的方法开发可以为实验室提高检测效率和节省成本提供了巨大的机会。以上BMV指导原则均从结构上拆分为方法开发、方法验证以及样本分析3个阶段，其中方法学验证又分为全验证、部分验证和交叉验证。无论是色谱法还是配体结合分析法，全验证包括的主要指标基本相同，但略有差异，见表2，对于部分验证和交叉验证的适用条件也基本相同，差异微小，见表3。对于部分验证，M10、FDA/BMV/2018、EMA/BMV/2012以及ChP/9012/2015均未做明确说明，可操作空间较大，实验室可以基于科学性论证后进行部分验证：可以仅是一个准确度和精密度验证(A&P run)，也可以近乎全验证。注：（+）：只提及，未明确评估方法和接受标准；+：需进行此项考察并设立接受标准； <+>：提及做法，未明确接受标准；-：未提及。注：＋：当对应条件改变时需要进行部分验证；-：未提及EMA/BMV/2012 、ChP/9012/2015以及M10对色谱法和配体结合分析法进行分开描述， FDA/BMV/2018也将色谱法和配体结合法的验证参数分别在表格中进行汇总，虽然行文内容上有些重复，但是两种检测方法检测原理和操作团队通常不同，非常利于实验室进行操作和管理。色谱法相对于配体结合法更为成熟，验证的内容和接受标准见表4。色谱法发展多年，各个指导原则中验证内容和接受标准差异较小，其中较明显的差异包括：（1）对于选择性，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015强调联合用药、代谢物、降解产物的影响，未单独要求特异性考察，全部放到选择性下进行考察，接受标准与选择性相同，M10除了常规要求外，特别强调了高脂基质的选择性考察要求：高脂基质应取自于捐献者，难于获取的可以用甘油三酯配置，当药物影响脂代谢或者用于高脂人群时必须采用捐献者的基质。（2）对于基质效应，EMA/BMV/2012和ChP/9012/2015给出了具体的做法，即：采用内标归一化因子进行评价，具有实际的指导意义；M10则采用不同来源的基质制备的质控样品的准确度和精密度来评价，特别强调了高脂基质、溶血基质、肝功能不全患者、肾功能不全患者等特殊基质的基质效应考察要求；而FDA/BMV/2018在这一重要方法参数上没给出具体的操作方法和判断标准。（3）对于分析批容量，只有M10特别强调了考察要求，要求采用含基质样品进行考察，且分析批容量能覆盖实际的研究样品检测时的分析批容量。（4）对于重进样重现性，ChP/9012/2015中要求如发生仪器中断或者设备故障造成的重进样时应评价，如何评价以及接受标准未做明确要求，M10明确了考察方式和要求，而EMA/BMV/2012和FDA/BMV/2018未强调该要求。（5）对于灵敏度， FDA/BMV/2018要求LLOQ的信噪比应大于5，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015除了上述要求外，还要求LLOQ应满足小于等于Cmax的5%，而M10对此并无规定，只要分析结果的准确度和精密度满足要求即可。（6）对于提取回收率，EMA/BMV/2012、ChP/9012/2015未做要求，FDA/BMV/2018和M10均要求对回收率进行考察，且明确了内标与待测物回收率应一致,但并未给出具体的接受标准，如何科学合理的设立这一标准也必将成为业界的一个论点。对于配体结合分析方法， M10与EMA/BMV/2012、FDA/BMV/2018、ChP/9012/2015验证的内容基本相同，包括：特异性、选择性、标准曲线及范围（定量下限至定量上限）、准确度、精密度、残留（如有必要）、稀释线性、平行性（如必要）和稳定性，考察方法和接受标准上基本相同, 各个指导原则考察项和接受标准的异同点详见表5。
注：LLOQ: 定量下限；ULOQ:定量上限；MQC:中浓度质控样品；HQC:高浓度质控样品；DQC：稀释质控。
对于配体结合法，各个指导原则中验证的内容和接受标准虽差异较小，但也不完全相同，差异主要集中在特异性、选择性、残留、稳定性条件的覆盖范围以及平行性上。已测样品再分析（Incurred Sample Reanalysis，ISR）通过在一定时间周期内重复分析试验样品，评价生物分析方法对实际样品测定的准确程度，是方法学验证的重要部分。M10、EMA/BMV/2012 、FDA/BMV/2018 以及ChP/9012/2015在ISR开展情形、样品选择、接受标准上保持相同，但对于ISR过程中的异常情况以及异常结果的调查上，FDA/BMV/2018、 EMA/BMV/2012 、ChP/9012/2015意见不明确，要求各个实验室遵循既定的SOP或者调查方案，M10给出相对具体的操作和处理意见：（2）对于需要进行关注及调查的情况也做了明确：ISR失败、同一受试者的所有样品ISR均失败、同一分析批的所有样品ISR均失败，此时应对ISR进行关注和调查。对于ISR调查和评估的所有情况都应记录，以便改进和调查。（3）对无需进行关注及调查的情况也做了明确：当个别样品原始值与ISR值有很大差异时（如，> 50％，“异常值”）不应对原始样品进行重新分析，也不需要进行调查。笔者认为此种要求会限制数据的客观性，实验室可能的取样错误可以通过ISR来发现并纠正, 若不对个别的差异较大的ISR样品进行调查，则难以发现此种操作错误，也会降低数据的科学性和客观性。因缺乏不含分析物的基质和缺乏具有准确已知分析物浓度的标准物质，内源性化合物的定量分析而变得非常复杂。针对内源性物质特殊的要求，业内也一直在尝试科学可行的生物样品分析方法。FDA/BMV/2018只提出了一些关于使用不含分析物的基质或QCs制剂的一般建议，但是如何操作以及接受标准未做具体规定，操作性较差，而M10则弥补了这一缺陷，在内源性物质的生物样品分析方法的建立和验证上，M10给出更加科学和具体的指导建议, 推荐了4种方法进行内源性物质检测方法：标准加入法、背景扣除法、替代基质（简化基质、人造基质或经净化的基质）法和替代待测物法, 且对于质控样品以及标准曲线以及验证指标和接受标准给出了建议，更具操作性，为进一步明确内源性物质分析方法验证和样本分析奠定了良好的基础。正如前文所述，在过去30年生物分析实践经验积累以及法规发展的背景下，生物分析监管模式也在不断演变，虽各大指导原则略有差异，但主体内容越来越趋于一致，形成全球可接受并相对明确和一致的生物分析规范势在必行，M10草案的发布必将加快这一步伐。生物分析的全球标准化进程也必将对制药行业产生积极的影响：对生物分析实验室，无需频繁升级标准操作规程和调整报告格式即可满足不同区域的申报要求；对于制药公司，促进创新药和仿制药注册数据的全球通用，可避免研发资源的重复浪费，加快审评和上市速度；对于监管部门，已核查实验数据全球范围互认，可提高监管效率，节约监管成本。利益冲突声明：本文的观点仅代表作者在该主题上的观点和立场，本文作者与文中的任何组织机构等均无利益关系或利益冲突。特此声明。[1]International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). https://www.ich.org[2] European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en[3] European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations. https://www.efpia.eu[4]American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS). https://www.aaps.org/home[5] European Bioanalysis Forum. http://www.e-b-f.eu[6] 国家药品监督管理局 http://www.nmpa.gov.cn[7] ICH. Harmonised Guideline-Bioanalytical Method Validation (M10 Draft version). 2019.02.[8] 中国药典. 9012 生物样品定量分析方法验证指导原则. 2015年版.[9] EMA. Guideline on bioanalytical method validation. 2012.02.[10] FDA. Bioanalytical Method validation Guidelines. 2018.05.[11] Booth B, Vazvaei F, Fluhler E, et al. AAPS workshop report on ICH M10. AAPS J. 22, 10 (2020).[12] Timmerman P, Arnold M, DeSilva B, et al. Introduction to the proposals from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16, 1159–1161 (2014).[13] 张玉琥, 药品注册生物等效性试验中常见问题分析[J]. 中国新药杂志, 2011.20(1).[14] 陈笑燕, 詹燕, 钟大放. 生物样品定量分析方法验证中试验样品再分析的意义和对策[J]. 中国药学杂志, 2014, 13(49): 1176.[15] 张双庆, 范玉明. 大分子生物药物生物分析方法验证—解读欧洲药品管理局指导原则[J]. 国外医药抗生素分册. 2012.9, 33(5).[16] 梅和坤, 王瑾等. 国内外生物类似药研究指导原则要点之比较[J]. 中国新药杂志, 2018 , 27 (21 ).[17] 魏敏吉, 李可欣. 符合法规和指南要求的生物样本分析[J]. 药物分析杂志, 2014, 34(1):12.[18] Findlay JW, Smith WC, Lee JW, et al, Validation of Immunoassays for bioanalysis: A pharmaceutical industry perspective[J]. Pharm Biomed Anal, 2008, 21, 1249 –73.[19] P. Ravi Sankar, A. Sai Geethika, G. Rachana, et al, Bioanalytical Method Validation: A Comprehensive Review[J]. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 2019.6, 56(1):50-58.[20] Michał Kaza, Marta Karaźniewicz-Łada, KatarzynaKosicka,et al. Bioanalytical method validation: new FDA guidance vs. EMA guideline. Better or worse[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2019.2, 165:381-385.[21] Timmerman P, Lowes S, Fast DM, et al. Request for global harmonization of the guidance for bioanalytical method validation and sample analysis[J]. Bioanalysis, 2010. 2(4), 683.
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