“精准医学的未来会非常非常重要，但它也许会发展成为普通人用不起的贵族医学。”在组学（基因组、蛋白组等）、生物信息、大数据等前沿科技推动下的精准医学大潮之中，大多数研究人员都在寻找关于特定疾病、特定患者的个体化精准诊疗方案，尤其是针对发病率和致死率双高的癌症。然而，复旦大学生物医学研究院 PI、于文强博士带领的表观遗传研究团队选择反其道而行，寻找所有肿瘤共同的诊疗方案。“精准医学的核心其实就是个性化医学，而要让每个人都用得上、用得起精准医学带来的成果，并不现实。我认为所有的肿瘤应该有共同的发病机制，如果把这背后的机制搞清楚，就一定会找到所有肿瘤的共同治疗方案，” 于文强补充说，“当然，这可能需要很长时间”。图丨复旦大学生物医学研究院 PI 于文强教授（来源：受访者提供）近年来，大量研究表明，DNA 甲基化异常与肿瘤的发生、发展有着密切的联系，是肿瘤发生过程中最常见的表观遗传异常现象，包括某些基因启动子区域 CpG 岛甲基化水平升高导致的抑癌基因沉默 / 损伤修复基因失活，以及全基因组水平的 DNA 甲基化降低致使原癌基因和转座子区域的活化，染色体稳定性下降。也就是说，在正常细胞变成肿瘤细胞的过程中，DNA 甲基化也将发生某种变化，进而人们可以通过检测这一变化识别肿瘤细胞。由此，DNA 甲基化检测已然成为全球肿瘤早筛的主流技术路线。虽然与大多数人的思路不同，但于文强寻找所有肿瘤共同检测方案的着手点，同样也是 DNA 甲基化。经过近 20 年的探索研究，他似乎找到了如何实现这一目标的方向。今年 6 月，于文强团队联合上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院、复旦大学附属妇产科医院、复旦大学附属金山医院、上海奕谱生物科技有限公司等在 Clinical and Translational Medicine 上发表了其发现的第二个或可适用于全部癌症的甲基化标志物 PCDHGB7，他们将这类标志物命名为 “全癌标志物”（Universal Cancer Only Marker，UCOM）。（来源：Clinical and Translational Medicine）此前，该团队于 2019 年在 Cancer Research 上发表了其发现的第一个全癌标志物 HIST1H4F。“但其实，全世界都在说每种肿瘤基本上都不一样，都在做精准医学（个性化医学）的时候，我们说发现了全癌标志物这样一个所有肿瘤的共同特征，绝大部分人是很难理解和接受的。”于文强也提到，“不过现在很多人在做泛癌标志物，说明大家还是希望能够有一种方法来诊断多种癌症，只不过我们具体采用的策略不同 —— 泛癌标志物筛查本质上是用多种标志物诊断多种肿瘤，就是把多种单一癌症标志物放到一个大 panel 里，通过这个 panel 内所有基因的检测去判断是否存在癌症，是'多对多’的关系。而全癌标志物是在目前研究的所有肿瘤中都存在的甲基化位点，全癌标志物检测就是用这样的一个或两个标志物诊断多种癌症，是'一对多’的关系。全癌标志物和泛癌标志物的目标都是一样的。”另外，于文强表示，“全癌标志物和泛癌标志物的检测方法也是不同的，目前泛癌标志物只能通过二代测序检测，相比之下，只有一个或两个位点的全癌标志物可以用 qPCR 等简单的方法检测。”随着 DNA 甲基化的研究发展，DNA 甲基化检测已可用于多种肿瘤的早期筛查、辅助诊断、疗效判定以及预后监测等，通常不同的肿瘤可分别通过不同的标志物检测出来。目前，DNA 甲基化检测主要通过焦磷酸测序或高通量测序（NGS）进行，若想获得人体全基因组范围内单碱基分辨率的所有 DNA 甲基化情况，则通常需要借助全基因组 DNA 甲基化测序技术（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）实现，只是这些方法的成本高昂，很难为寻常百姓所用。正如业内流传的那般，于文强也提到 “做 DNA 甲基化检测是有钱人的游戏”，他进一步说，这一方面是因为需要检测的位点很多，另一方面也是由测序的方式造成的。“当时（2010 年左右）二代测序的比对率不到 30%，造成数据浪费的同时，也是对人力和财力的极大消耗。”面对这一现状，于文强团队自主开发了新型测序技术（GPS），并通过这项技术发现了全癌标志物，目前已公开报告的有前文提到的 HIST1H4F 和 PCDHGB7。关于全癌标志物 HIST1H4F 的报告论文中显示，他们首先在肺癌中发现多个组蛋白基因异常的高甲基化状态。进一步验证中，他们在分析肿瘤基因组图谱 (TCGA) 数据库 17 种肿瘤（肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、宫颈癌等）的 7000 多例样本分析中发现，某些组蛋白基因在多种癌症中均存在甲基化异常现象，尤其是 HIST1H4F 基因。图｜17 种肿瘤中 85 种组蛋白基因的甲基化状态 (A)、HIST1H4F 在 17 种肿瘤中的甲基化状态（B）（来源：论文）为进一步验证这一现象，于文强团队在 8 种肿瘤临床样本中进行检测，他们发现，在这 8 种肿瘤样本中，HIST1H4F 均存在高甲基化现象。由此，于文强提出， HIST1H4F 是潜在的肿瘤共有标志物，"全癌标志物" 也是从这是开始提出的。“当用一个位点就能检测出癌症，成本自然很低，甚至比现在的新冠检测（2 个位点）更低。”图｜HIST1H4F 基因在 8 种肿瘤临床样本中的甲基化状态（来源：论文）这里的 GPS 是 Guide Positioning Sequencing 的缩写，含义也很直白，即 “导航定位测序”，正是前文提到的于文强团队历时 8 年开发的全基因组 DNA 甲基化检测新方法。如 Global Positioning System 一般，GPS（Guide Positioning Sequencing）也具有定位功能，不同之处在于，GPS 用于 DNA 甲基化的定位。全癌标志物的发现，也正是在 GPS 的基础上实现的。开发 GPS 的故事，要从于文强对线粒体 DNA 甲基化的兴趣说起。2009 年底，在瑞典乌普萨拉大学 Rolf Ohlsson 教授实验室和约翰霍普金斯大学医学院从事近 10 年 DNA 甲基化研究工作后，于文强回到中国，并选择一条与出国前不尽相同的医学道路 —— 从临床医生到专注科研。归国后，于文强来到复旦大学并牵头表观遗传学领域中国第三个 973 项目，进行 DNA 甲基化研究。“有一天，我在寻找线粒体 DNA 的甲基化信息，但竟然没有任何信息可用。当时我们已经进入二代测序时代，如果连仅有 16kb 的线粒体 DNA 都没有甲基化信息，那不能说线粒体 DNA 甲基化不重要，而是说明全基因组 DNA 甲基化检测一定存在什么问题 —— 序列比对率低、比对准确性差。” 这也正是 DNA 甲基化检测普及的障碍：价格高，但靠谱度低。“出现这两大问题是由于测序策略上出现了偏差，” 于文强说，“其实现在的 DNA 甲基化检测用的是一个非常绕的方法，先用 Bisulfite 处理 DNA 序列，把基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 T，以与原本具有甲基化修饰的 C 碱基进行区分，但是这样一来，原本人体基因组序列中的 4 个碱基就变成了 3 个，导致很多序列即使测到了也无法实现准确比对。”面对这一问题，他们决定尝试优化双端测序的方案，即一端是在 Bisulfite 处理后仍保持基因组原序列，另一端则是转化后的表观检测序列。具体实现上，“我们想到 T4 DNA 聚合酶，在反应体系中没有 dNTP 的情况下，可以发挥 3'-5' 外切酶的活性，当反应体系中存在 dNTP 时可以发挥 5'-3' 聚合酶的活性，不过在反应体系中，我们将 dNTP 中的胞嘧啶换成甲基化的胞嘧啶就可以了。这样一来，所有的 DNA 片段 3' 端在亚硫酸盐处理后还保持基因组序列，可用来定位；5' 端可以用来计算甲基化。"这种方法就是前文提到的新型测序技术 GPS（Guide Positioning Sequencing），于文强表示，目前该技术已经获得国内和国际专利。图 | GPS（Guide Positioning Sequencing）工作原理（来源：相关论文）从 “别人根本不相信”，到已完成近 2 万例样本筛查于文强与表观遗传学于 2001 年结缘，而他对医学知识的系统学习早在 1983 年开始。从 1983 年踏入、在四医大 12 年临床医生到如今走在医学科研最前沿，从 2001 年进入表观遗传学领域到发现或可适用于全部癌症的 DNA 甲基化标志物，于文强以 “我的经历背景比较简单” 这样平淡的一句话概括他深耕 30 多年的医学之路。但每每，说到全癌标志物的时候，他便滔滔不绝。“我认为，全癌标志物的发现意义非常非常重大，这可能会改变我们对肿瘤的很多理解。”只是，就如前文所说，目前全癌标志物的接受度并不是很高。于文强坦言，“很多人根本不相信。没关系，如果相信我们可以一起做研究，如果不相信，那也不要紧，时间会证明一切。”于文强表示，“我觉得做研究、做实验有一个事情非常重要，就是思维永远不能固化。世界上所有理论、定理、甚至真理都只是我们的'铺路石’，不能以此来束缚自己前进的方向，如果只是在那些固定框架里去做研究，那永远也跳不出这些框框。”在全癌标志物备受争议的大环境下，目前国内仅有上海奕谱生物基于这一方法进行肿瘤的检测，力图推动全癌标志物在肿瘤筛查中的应用。而“别人不相信”也为奕谱生物推动全癌标志物带来便利，“今年 3 月份出台的 LDT（Laboratory developed test, 临床实验室自建项目）合法化政策对全癌标志物的验证是一个很好的机遇，这比拿到证才能开始大规模临床试验有了先天的优势，因为只有这一家在做。”LDT 合法化：
2021 年 3 月 18 日，国家药监局网站发布修订后的《医疗器械监督管理条例》明确，“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。”
“基于 GPS 技术发现的全癌标志物检测已与国内多家医院展开合作，并在山东菏泽开展为期 3 年的两癌筛查公益项目，计划今年完成 1 万例样本检测，目前已经完成约 6000 例。我们希望通过这次大规模检测先把菏泽地区的宫颈癌发病率降下来”，于文强表示，目前全癌标志物最多的应用是开展对宫颈癌的早期筛查，其次是膀胱癌的术后复查。最后，他提到，在全癌标志物以及肿瘤方面，接下来他将继续探索全癌标志物在肿瘤中发生 DNA 甲基化的深层次机制，由此寻找肿瘤共同的治疗方案。
