玩转NGS实验室 | 第九期：肿瘤样本获取及处理方法
高通量测序 (Next Generation Sequencing，NGS) 技术因其通量、成本和效率等各方面的优势，在肿瘤、遗传病及病原微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。随着相关临床研究的持续深入，政策法规的引导与完善，进一步推动了该技术在院内本地化的应用。“玩转NGS实验室”专栏旨在从多角度探讨NGS技术院内本地化应用的相关规范、应用项目及重要进展，推动NGS技术的临床转化。
目前高通量测序技术可检测的DNA或RNA样本主要来源于患者的组织、细胞或体液。虽然来源不同，但在进行高通量测序检测时步骤相同，需要经过样本获取及处理—核酸提取—核酸质控—文库构建—文库测序—数据分析等步骤。其中针对不同样本类型、不同核酸类型（DNA或RNA），在样本获取、处理、核酸提取环节有一定区别。本篇将重点针对样本获取及处理环节的详细要求展开介绍。
样本的采集、处理及储存方法对高质量的测序结果至关重要。适合临床NGS分析的样本类型优选新鲜组织标本，也可选用甲醛固定-石蜡包埋（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE）样本、肿瘤细胞学样本及血浆（游离DNA/RNA）等[1]。对于肿瘤体细胞变异初次NGS检测时应首选经病理评估过的组织样本，在此基础上的再次检测可选取液体样本动态监测[2]。接受过靶向/免疫药物治疗的患者，应尽可能使用治疗后的样本，以寻找治疗后新出现的耐药突变[1]。
图1 非小细胞肺癌患者常见靶向治疗相关基因检测流程[3]
各类样本采集及保存
1
手术和活检的新鲜组织
采集要求：获取的样本应含有丰富肿瘤细胞，手术取样后用生理盐水冲洗至组织表面没有明显血迹，避免血液中gDNA污染。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果（手术采集的肿块组织不低于50mg（豌豆粒大小）。穿刺样本应≥2条，长度≥0.5 cm。新鲜样本中肿瘤细胞的比例不应低于20%）[1],[4]。
处理方法：迅速置于液氮或保存在样本保护剂中，尽早转移到液氮罐或-80℃冰箱（保存在样本保护剂中的样本，需按照保护剂要求的保存条件进行保存）。该过程应在手术离体后30min内完成，以防止RNA等核酸降解[5]。
评估方法：可采用冷冻切片染色评估样本中的肿瘤细胞含量[1]。
图2 左：液氮罐 右：液氮罐内提桶（用于液氮的取出及样本的保存）
2
FFPE样本
采集要求：按病理操作规范进行取材。尽量避免肿瘤细胞过少或未检测到的肿瘤组织、病变中心广泛纤维化的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、周围炎症严重的肿瘤、含坏死组织过多的肿瘤、含钙化灶并脱钙处理过的肿瘤（组织样本中肿瘤含量建议应达到20%以上，最佳含量为30%以上。肿瘤细胞体积至少达到0.2mm3。为保证 FFPE标本 DNA 提取的成功率，尽可能送检1年以内的蜡块或6周以内的石蜡切片，切片厚度 4～5 μm；手术样本（大样本）：≥5 张；穿刺样本（小样本）：≥10 张。若组织样本中肿瘤细胞含量较低，仍需进行NGS检测的话，应尽量采用显微切割技术富集肿瘤细胞，并在报告中提示样本局限性）[1],[6]。
处理方法：务必在组织离体后30min内浸入适量组织固定液中进行固定（液体与组织大小比例为10:1），避免使用酸性及含有重金属离子的固定液。大标本应切开后充分固定至6-48h，不超过72h。小活检标本可固定6-12h[1],[3]。
评估方法：制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色评估肿瘤细胞的含量[1]。
图3 FFPE样本切片示意图
3
血浆或血液样本
采集要求：cfDNA是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊。使用EDTA抗凝真空采血管，采集5-10ml外周血提取血浆游离DNA进行检测[1],[6]。
处理方法：使用EDTA抗凝真空采血管，采集5-10ml全血，4h内分离血浆，提取游离DNA，保存于-80℃冰箱中，并避免反复冻融[1]。如外周血需长时间运输，建议用商品化游离DNA样本专用保存管，如Sterck BCT管，在常温条件下，可稳定保存长达14天。
4
细胞学样本
① 脱落细胞学标本及细针穿刺细胞学标本用于基因检测时，必须进行病理质控，确定标本中的肿瘤细胞数量及与正常细胞的比例。符合质量要求或通过肿瘤细胞富集处理后符合要求的标本可直接抽提核酸，也可以制备成FFPE细胞学蜡块进行后续分析。
② 肿瘤科医师在申请胸水标本的基因检测时，必须同时进行液基细胞学检测来进行病理评估剩余液体冷藏/冷冻保存。体腔积液标本可提取无细胞上清标本中的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行检测[1],[3]。
用于突变基因检测时，离心后得到的细胞块样本的保存方法与组织样本相同[6]。
样本保存与处理
肿瘤个体化治疗基因检测报告发出后的剩余样本应尽可能较长期保存。实验室应制定样本储存制度对样本进行保存，建立样本储存的规章制度，做好样本的标识并按规定存放，保存好样本的原始标码，建立配套的样本存放信息管理系统。样本的处理和相关材料的处理要符合《医疗废物管理条例》、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》及国家、地区的相关要求[6-7]。
图4 用于保存样本的-80℃冷冻冰箱示意图
对于大型机构来说，生物物样本库是样本保存、重要科研成果快速产业化、成果应用到临床及实现“转化医学”的重要保证。生物样本库主要是指标准化收集、处理、储存和应用生物体（健康/疾病）的细胞、组织、血液、器官等样本，以及与这些生物样本相关的临床、病理、治疗、随访、知情同意等资料及其质量控制、信息管理与应用的系统。
自动化样本库相对于传统生物样本库模式（人工+冰箱）来说，具有节能、存储信息准确、安全高效、信息化等优势。其在支撑精准医疗、全民大健康、新型农业、物种多样性、海洋水产、微生物研究等领域发挥的作用不容小觑。
总结：
样本获取后质量的评价对后续结果的解读有重要意义，临床样本的采样过程、分析前的运输和处理以及病理的评估结果等均应做相应的记录。质量评价的内容应包括肿瘤细胞含量比例、肿瘤细胞的数量，是否按照要求进行处理与运输等。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察等。对于肿瘤细胞分布集中的区域应进行标注，必要时进行显微切割后再提取核酸[1]。