膜拜时刻：发表在cell（IF=38.637）的生信+实验文章是如何做的
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联系人类正向选择和代谢紊乱的MicroRNA
一、研究背景
乳糖不耐受是因为我们体内乳糖水解酶（LCT）的基因表达在断奶之后就被关闭了，故而一部分人无法降解乳糖。然而在一些欧洲人群中，他们的乳糖水解酶被选择性地保留下来以抵抗食物不足引起的饥饿，具有永久表达的特征（LP）。作者通过GWAS分析发现，LP位点单倍型可能会与成年后的一些代谢功能异常相关，多表现为肥胖或发展为高风险二型糖尿病。另外，作者还发现表达miR-128-1的基因定位于距离乳糖水解酶SNP200kb的染色体核心位点。这篇文章就是为了探究miR-128-1是否与LCT基因所在染色体决定的代谢疾病和正向选择相关。
二、研究内容
1、GWAS分析表明多个物种2q21.3染色体位点包含若干个选择信号
作者用GWAS（全基因组关联分析）试图找到miR-128-1在进化上的正选择性。结果发现，在不同物种（牛、犬科）中的2q21.3染色体上均有相似的等位基因，这一基因均与哺乳动物的体重快速增长相关。
下图：在哺乳动物中的2Q21.3基因座的选择
A、通过使用多信号复合评估，发现在2q21.3基因座中存在强烈的阳性选择信号。
B、狗，奶牛和人类中的代谢及拟人性特征辨析。
C、聚集特征显示出强烈的效果，主要是小浓度的体组成和肥胖。
D、来自不同欧洲群体的古代DNA揭示了一个存在于轨迹处的共享选择活动。
2、正向选择的基因单倍型与染色质可及性和位点的表达模式相关
作者通过进一步的分析（GWAS、eQTL等），利用多种数据库（GDSC、CCLE、METSIM、FINEMAP），发现2q21.3染色体的多态性正选择位点（LCT周围）造成染色体可及性的改变，导致miR-128-1以及共表达基因的高表达，这些基因又与血液、脂肪细胞中的胆固醇、脂蛋白-胆固醇、葡萄糖醇的代谢相关。
下图：人体中miR-128-1周围区域的127个细胞类型
A、染色质状态图的2q21.3调节通路。
B、HI-C（GM12878）表示稳定的染色质域，其边界与RS1438307重合。
C、拓扑结构域广泛视图揭示了较大的域结构，包括Rab3Gap1。
D、在变体基因座RS1438307的编码细胞系中，兴趣峰的强度和R3HDM1基因的表达强烈增加。CTCF芯片-SEQ-SEQ富集在UBXN4基因（左）的转录开始点（TSS）附近的富集分布以及用于编码样品的R3HDM1（右）的表达。来自GDSC的CellminerCDB的数据显示，R3HDM1与MCM6跨越基因座中的基因高度相关。
E、miR-128-1的表达与宿主基因R3HDM1（CCL）的表达高度相关。
3、抑制miR-128-1可提高能量消耗
作者用了比较常规的反义核苷酸技术，将anti-miR寡核苷酸注射到饮食诱导的肥胖小鼠模型（DIO）中。约4个月之后，与对照组相比，小鼠的体重明显下降，脂肪细胞肥大、炎症、脂肪肝、葡萄糖稳态都得到改善，能量消耗增加。miR-128-1靶标的代谢相关基因表达显著上升。
下图：miR-128-1通过抑制miR-128-1ASO防止饮食诱导的肥胖症，降低脂肪细胞肥大和炎症，防止肝脏脂肪变性和炎症，增加全身能源支出，并改善葡萄糖稳态。
A、用miR-128-1ASO治疗的DIO小鼠的图片以及8周的抗miR治疗。
B-D、dio小鼠组织来自miR-128-1ASO和对照处理组的图像（每组n=10）。
E-G-I、来自miR-128-1ASO和对照治疗组的BAT，EPI-Wat和肝脏的代表性组织学数据（H＆E和IHC）（每组n=6）。
F-H-J、蝙蝠同一性相关的标记基因的表达。
K-M、通过RT-PCR和Western印迹测定与葡萄糖稳态和能量消耗相关的肌肉中标记基因的表达。
N、在miR-128-1ASO和对照组之间的代谢中测量全身能量支出差异（每组n=10）。
O-P、在miR-128-1ASO和对照治疗后14周后进行腹膜内（IP）-葡萄糖耐受和胰岛素耐受试验。
4、证明miR-128-1是调控葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的关键因子
肥胖和肌肉及肝脏的白色脂肪过度堆积通常与胰岛素抵抗和葡萄糖稳态密切相关，也是二型糖尿病的主要风险因素。因此作者又检测了miR-128-1抑制小鼠的葡萄糖代谢情况和胰岛素敏感性。结果表明，随着miR-128-1抑制小鼠体重和体脂的下降，肌肉的葡萄糖吸收水平和胰岛素敏感性都显著提高，小鼠的葡萄糖调控能力大大改善。这些指标在瘦素缺乏的肥胖小鼠模型（ob/ob）中也获得了一致的结果。
下图：DIO小鼠的抗miR-128-1治疗改善了肝，骨骼肌和脂肪细胞胰岛素敏感性
A-B、正常体重和抗miR-128-的体重百分比治疗和控制HFD喂养小鼠。
C、高胰岛素血症-Euglycexcex夹持过程中的血浆葡萄糖浓度。
D、在钳位研究期间维持euglycemia所需的葡萄糖输注速率。
E、稳定状态（100-140分钟）在夹具期间维持晚期血症所需的葡萄糖输注率。
F、胰岛素刺激的葡萄糖摄取在骨骼肌和白色脂肪组织中。
G、胰岛素介导的夹持过程中内源性葡萄糖产生的抑制。
H、胰岛素介导的夹层血浆Nefa的抑制。在所有面板中，数据表示为每组n=7只小鼠的平均值±SEM，由2尾配对（基础与夹具）或未配对的比较（对照与miR-128-1ASO）的T测试。
5、miR-128-1敲除小鼠具有更强的能量消耗和葡萄糖代谢能力
为了证明miR-128-1在DIO小鼠模型中节省能量的作用，作者在DIO小鼠中敲除miR-128-1。敲除小鼠确实展现出更低的体重和体脂率，更高的能量消耗能力和葡萄糖代谢能力，与miR-128-1抑制小鼠的表现一致。
下图：miR-128-1缺乏防止肥胖，增加全身能源支出，并改善葡萄糖稳态
A-B、正常体重和超重小鼠和miR-128-1ko小鼠的身体组成（每组n=10）。
C-D、在代谢笼中测量miR-128-1ko和WT小鼠之间的全身能量支出和活性差异（每组n=10）。
E、较低温度下的直肠温度-正常散步miR-128-1KO小鼠和WT动物（每组n=6）。
F、将BATKO组UCP1的代表性IHC与WT小鼠进行比较（每组n=6）。
G、从miR-128-1KO和WT小鼠中分离的棕色脂肪细胞的能量消耗差异。
H-I、miR-128-1KO和WT小鼠的IP-葡萄糖耐量和胰岛素耐受试验在10周的HFD饲养中进行。
6.miR-128-1调控白色脂肪细胞的分化和功能
体外细胞内研究具体的调控机制。在白色脂肪前体细胞中分别表达和敲减miR-128-1，脂肪细胞分化分别降低和提高。细胞分泌的脂连蛋白和瘦素，以及miR-128-1的靶基因，包括靶基因调控的通路均有预期的显著变化。
下图：miR-128-1在原发性人体脂肪细胞中的操纵改变了分化状态，能量消耗和瘦素脂联素分泌。
A-D、预先抑制miR-128-1的过表达，导致原发性人脂肪细胞分化和减少脂肪细胞标志性基因表达。抗miR-1281促进原发性人脂肪细胞分化，并上调adipocytehallmark基因表达。
E-F、用miR-128-1预光碱基和抗miR-128-1治疗的人原发性脂肪细胞分泌的瘦素和脂肪蛋白的水平。
G、通过Western印迹确认原发性人脂肪细胞中脂肪细胞基因的细胞水平。
H-I、评估过表达miR-128-1或敲低诱导的原发性人脂肪细胞的粮农组织变化。
7.miR-128-1抑制棕色脂肪细胞生成和能量消耗
相比于白色脂肪的堆积降低细胞对葡萄糖的耐受性，棕色脂肪能够提高细胞的代谢。为了探究miR-128-1是否对棕色脂肪细胞也有调控作用，作者在初级棕色脂肪细胞中过表达/敲减/敲除miR-128-1。无论是敲除还是敲减microRNA，棕色脂肪细胞的分化、细胞呼吸作用、能量消耗均显著加快，代谢通路相关的靶基因表达量显著提升。
下图：miR-128-1对照对原发性棕色脂肪细胞分化/身份和能量消耗并限制肌肉细胞对棕色脂肪细胞谱系的跨分化
A、miR-128-1WT和Ko原发性棕色脂肪细胞诱导分化成熟棕色脂肪细胞。
B、通过海马分析测量miR-128-1WT和KO棕色脂肪细胞的线粒体呼吸。
C-G、通过RT-PCR测量miR-128-1WT和KO棕色脂肪细胞miR-128-1WT和Ko棕色脂肪细胞的棕色脂肪细胞标记基因表达。
H-M、引入miR-128-1前光标或抗miR-128-1进入成熟的棕色脂肪细胞。
H-K、RT-PCR棕色脂肪标志物基因和能量消耗基因表达分析。
H-M、棕色脂肪细胞活化剂Dbcamp刺激成熟小鼠棕色脂肪细胞中的PGC-1A和UCP-1表达。
N、抗miR-128-1将C2C12肌细胞分化为棕色脂肪细胞。在治疗8天后，C2C12肌细胞进行染色。
O-Q、泛脂肪细胞和棕色脂肪糖特异性标记表达由RT-PCR和Western印迹测定。
R、在肌室标记基因表达的RT-PCR分析的C2C12肌细胞分化的5天后评估myotube形成。
S-T、通过抗miR-128-1治疗诱导棕色脂肪细胞分化诱导棕色脂肪细胞分化后测量相关组织和线粒体呼吸。
三、小结
很多人说，现在做生信只能灌水，其实我的想法是：一个项目，是否能发高分，不仅需要大量的实验积累，更需要有一定的创新性。而数据挖掘和生物信息学能在很大程度上给我们的研究提供便利。