Molecular Cancer | c-Myc互作circRNA研究
10月26日，Molecular Cancer杂志在线发表了浙江大学邵逸夫医院范顺武和马建军为共同通讯作者的研究文章，报道circECE1通过结合并稳定c-Myc调控骨肉瘤有氧糖酵解作用 [1]。
circRNA结合并调控蛋白的功能的研究热度越来越高，是circRNA接下来研究的重点方向之一。
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本文作者通过RIP实验捕获与c-Myc结合的circRNA，通过芯片分析鉴定了捕获的circRNA分子，结合表达分析，最终选定circECE1作为候选分子进行后续的研究。首先分析了circECE1在骨肉瘤中的功能，证明circECE1在骨肉瘤中具有促进增殖和迁移侵袭的作用。紧接着，分析了circECE1与c-Myc相互作用的分子机制。生物学功能方面，作者发现了circECE1与骨肉瘤有氧糖酵解有关，并进一步证明了这个功能是通过与c-Myc结合实现的，最后在体内模型中验证了circECE1的功能。通过RIP捕获产物鉴定入手，找到候选circRNA分子进而分析表达和功能是该项工作的主思路，也是亮点之一。下面就让我们一起看看这篇文章的一些具体内容：
如何鉴定到circECE1的？
c-Myc是著名的癌基因，也是一种转录因子，有没有可能某些circRNA结合在c-Myc上面并影响了c-Myc的功能？基于这一假设，作者首先利用anti-Myc的抗体进行RIP实验，捕获的RNA进行芯片法分析（高通量测序也是可行的选择），从测到的分子中分析捕获比例，结合临床骨肉瘤标本和细胞系中QPCR检测，发现来自ECE1基因2-4外显子的circRNA（circECE1）在骨肉瘤中显著高表达，在anti-Myc的RIP实验中也可以被显著的捕获。FISH检测发现circECE1在胞质和核中均有定位。
图1 anti-Myc RIP捕获circECE1，骨肉瘤中表达分析 （[1]）
骨肉瘤中circECE1功能分析
为分析circECE1在骨肉瘤中的功能，首先通过过表达和敲降circECE1分析细胞增殖，迁移侵袭等。结果显示circECE1可以在骨肉瘤中促进细胞增殖和迁移侵袭。
图2 骨肉瘤中circECE1功能分析 （[1]）
circECE1与c-Myc相互作用的机制
为分析circECE1与c-Myc的相互作用分子机制，作者通过构建c-Myc的不同片段融合Flag的系列突变，看捕获circECE1的效率，结果显示，144-240的片段是结合circECE1是区段。基于catRAPID 和CISBP-RNA预测，分析circECE1中与c-Myc相互作用的位点，突变实验证明该位点突变后不再与c-Myc有相互作用。实验中作者发现过表达circECE1能同步增加c-Myc的蛋白表达量，但对c-Myc基因mRNA影响不显著。放线菌酮处理实验分析c-Myc蛋白的半衰期，结果表明过表达circECE1能显著延长c-Myc 的半衰期，但过表达突变的circECE1没有这种作用。已知c-Myc可以通过泛素化后被蛋白酶体降解，蛋白酶体抑制剂Bortezomib可抑制c-Myc的降解。干扰circECE1后，不添加Bortezomib c-Myc可以被迅速降解，但添加Bortezomib后不再被降解。说明circECE1结合c-Myc可以阻止c-Myc被蛋白酶体降解。
已知SPOP是介导c-Myc泛素化的E3连接酶，在干扰circECE1的同时干扰SPOP则能起到与Bortezomib相似的效果，说明SPOP是circECE1结合并稳定c-Myc作用过程相关的下游分子。SPOP结合下游分子通过ϕ π S S/T S/T（ϕ-nonpolar; π-polar）的motif，在c-Myc中存在两个这种motif，分别命名为SBC1和SBC2，其中SBC1恰好位于circECE1与c-Myc结合的区段。CoIP实验证明了干扰circECE1可以促进SPOP与c-Myc 的结合。SBC1和SBC2突变体实验证明了两个位点均与SPOP结合c-Myc 有关。这些数据说明circECE1可以通过结合c-Myc，阻碍SPOP的结合，进而降低c-Myc被泛素化修饰和降解的效率，起到促进c-Myc蛋白稳定的作用。
图3 circECE1与c-Myc相互作用机制分析 （[1]）
circECE1调控有氧糖酵解作用
c-Myc可以通过调控一些糖代谢酶的表达，调控肿瘤代谢途径。circECE1是否也可以多这些酶的表达有调控作用呢？干扰和过表达circECE1表明，circECE1表达升高有利于这些酶的表达升高，反之，干扰circECE1则同时导致这些代谢酶的表达下降。JC-1检测线粒体膜电势，乳酸生成率检测以及SeaHorse呼吸代谢检测仪结果均表明，circECE1表达升高有助于有氧糖酵解作用。
图4 circECE1调控糖代谢 （[1]）
上述实验表明circECE1可以结合c-Myc，也可以促进骨肉瘤有氧糖酵解作用。那么circECE1对有氧糖酵解途径的促进作用是否依赖c-Myc呢？干扰c-Myc的同时过表达circECE1实验证明了circECE1的确需要有c-Myc 的存在才能促进相关酶的表达。单独过表达突变型的circECE1不能促进有氧糖代谢和ATP的生成，也不会促进细胞增殖。
图5 circECE1通过c-Myc调控糖代谢 （[1]）
circECE1
为分析circECE1通过c-Myc调控有氧糖酵解作用的机制，作者分析了过表达circECE1前后全转录组的变化水平，测序结果显示TXNIP在过表达circECE1后显著下降。分别干扰circECE1和c-Myc表明两者均有抑制TXNIP表达的作用。荧光素酶实验，ChIP实验验证了c-Myc结合TXNIP启动子的作用。干扰和过表达TXNIP的实验表明，TXNIP负调控相关代谢酶的表达，也负调控细胞的增殖和迁移侵袭。过表达circECE1后代谢酶表达增高，但同步过表达TXNIP则抑制这一作用。代谢检测，增殖分析等实验均证明了这一调控关系。
图6 骨肉瘤中TXNIP与糖代谢和增殖的关系 （[1]）
circECE1体内功能分析
裸鼠皮下成瘤模型分析了过表达circECE1野生型或突变型的成瘤效率。过表达野生型circECE1能促进成瘤，而突变型的增高不显著。过表达circECE1组c-Myc的蛋白含量升高，有氧糖酵解相关的代谢酶表达也增高，但突变型的没有这个效应。TXNIP的表达与代谢酶的表达变化相反。
图7 体内circECE1功能研究 （[1]）
本文工作的几点启发
本文介绍了从RIP捕获产物中鉴定到circECE1后分析了功能和互作机制，并在裸鼠成瘤模型中验证了相关的现象。以下几个方面对circRNA的研究有所启发：
（1）circRNA与蛋白的相互作用是circRNA的一个重要功能途径。生物大分子的相互作用是发挥功能的重要途径，circRNA作为非编码RNA的一类，与其他分子的相互作用是非常重要的功能途径。本文的工作再次印证了这一观点。
（2）从已知蛋白入手，通过RIP捕获相互作用的RNA分子，经过高通量芯片或测序检测这些分子将会成为挖掘相互作用非编码RNA分子的重要技术手段。
（3）从本文的介绍来看，与c-Myc相互作用的circRNA或其它RNA分子肯定不止circECE1，这说明即使已经有报道的明星蛋白，也可以在不同疾病，不同研究体系中分析一下相互作用的RNA分子。这也预示着RNA-蛋白相互作用的分析将是长期有效的研究思路。
参考文献
1. Shen, S., Yao, T., Xu, Y. et al. CircECE1 activates energy metabolism in osteosarcoma by stabilizing c-Myc. Mol Cancer 19, 151 (2020). https://doi.org/10.1186/s12943-020-01269-4