揭开面纱：解析mRNA 疫苗的设计原理、递送系统以及工业化生产
RNA的任务是在核糖体中将DNA翻译后合成蛋白。
人工合成的mRNA疫苗为核糖体提供病原体抗原的遗传信息，发布合成病原体抗原的构建指令。蛋白抗原合成后，激发机体的免疫系统识别并清除具有这些蛋白特定表面特性的病原体。
传统的活/灭活疫苗本身就是引发免疫反应的抗原，而mRNA疫苗则是在机体细胞中产生抗原。
在过去的几十年里， 人们通过对mRNA的药理学的研究、开发有效的递送载体和对mRNA的免疫原性有效控制，使得mRNA疫苗从一个受人质疑的想法变成了临床现实。在2020年COVID-19大流行期间，mRNA疫苗一鸣惊人，以前所未有的速度研发成功并供全球数百万人使用。让人们重燃对mRNA疫苗的热情和兴趣。
与传统疫苗相比，mRNA疫苗有以下几个优势： 首先，mRNA不整合到基因组中，避免了突变的问题；其次，mRNA疫苗的生产无需细胞环境，生产流程简单，大大加快了生产周期。而且单一的mRNA疫苗可以编码多种抗原，靶向多种病原体，也可增强对变异病原体的免疫反应。另外mRNA疫苗生产过程可标准化，几乎可以生产任何序列的免疫原，适合快速应对新出现的传染病。然而，mRNA的不稳定性、低效和过度的免疫刺激也阻碍了其临床上的应用。在本文将为大家介绍mRNA的设计的优化、细胞内传递以及mRNA疫苗的GMP生产的主要焦点。
图一：mRNA疫苗的合成与生产
体外转录的（In vitro-transcribed，IVT ) mRNA模拟内源性mRNA的结构，依次包括 以下必要元件：5’cap、5’UTR（untranslated regions UTRs)、编码抗原蛋白的开放阅读框（open reading frame，ORF)、3’UTR和poly（A） 尾 。
图二：IVT mRNA的结构
5 ' cap结构（m7GPPPN）与 mRNA的稳定性密切相关。其中5 '端第一个或第二个核苷酸甲基化可以阻止细胞质传感器对病毒RNA的识别，从而降低mRNA疫苗的免疫原性。此外，5 ' cap结构还可以保护mRNA不被外切酶降解，并通过与3 '的poly(A)尾、poly(A)结合蛋白和翻译起始因子的协同作用，使mRNA环化，招募核糖体启动翻译。
poly(A)尾的长度（100-150 bp）可以间接调节mRNA的翻译和半衰期。poly（A）尾与poly(A)结合蛋白结合形成复合物，启动蛋白的合成（翻译），并可通过降解脱帽酶（decapping enzymes）保护cap结构。
编码区两侧5 '和3 ' UTR可调控mRNA翻译、半衰期和亚细胞的定位。通常高表达的天然UTR（如α-和β-globin 基因）是用于mRNAs合成的首选。值得注意的是，由于UTR性能因细胞类型而异，需要根据所靶向的细胞对UTR序列进行优化。
mRNA疫苗的ORF包含用于编码蛋白的序列，是最关键的元件。在不改变蛋白质序列的前提下，将ORF中稀有密码子替换为常用的密码子，可提高翻译效率。CureVac AG公司将新冠候选疫苗CVnCoVde的ORF中第三位的A或U替换成G或C（人mRNA密码子的第三位罕有A或U）。虽然这是一种很有吸引力的优化策略，但仍须谨慎使用，因为对于某些蛋白来说，稀有密码子较慢的翻译速率正是蛋白正确折叠所必需的。
天然mRNA序列几乎都包含修饰的核苷（如假尿苷），因此未经修饰的RNA就会露出破绽，被TLR3、TLR7和TLR8，以及RIGI等模式识别受体识别，从而阻断相应蛋白的合成。因此使用修饰过的核苷（特别是修饰过的尿苷），可以逃过模式识别受体的识别。Moderna和辉瑞 的mRNA新冠疫苗都应用了这一优化策略。
除了对mRNA各个元件进行优化，人们还简化了mRNA的生产。其中TriLink公司研发的CleanCap®的共转录加帽法最大限度地减少了mRNA 制备的步骤以及酶的使用。另外在DNA质粒中加入poly（A）尾（100bp）可以解决因多聚酶聚腺苷酸化所产生的尾长变异。但是编码poly（A）尾的序列会破坏DNA质粒的稳定性。在poly(A)尾加一个UGC短连接就可解决接这一问题。辉瑞的新冠疫苗BNT162b2就使用了一个10 bp的UGC连接。
这些创新克服了mRNA疫苗生产的种种瓶颈，促进了简单、经济、可扩展的mRNA合成工艺的发展。
裸mRNA在体内递送几乎是不可能的。首先， 无处不在的RNA酶极有可能在mRNA进入细胞之前就将其降解；其次，mRNA分子无法通过细胞膜的阴离子脂质双分子层（分子大(104–106 Da)且带负电荷）；此外，机体固有免疫系统会识别、吞噬、并最终降解mRNA。因此，需要合适的载体对裸RNA进行包装并完成递送使命。目前常用的载体有脂 类 或 类 脂 材 料、聚合物递送系统和阳离子纳米乳剂等。
图三：mRNA递送载体都含有阳离子或可电离的分子
脂质体纳米粒子递送系统
（Lipid-based nanoparticles，LNPs）
脂质体纳米颗粒（LNPs）是目前临床上最先进的mRNA递送载体。截至2021年6月，所有开发中或已获批的新冠mRNA疫苗均使用LNPs递送。LNPs有以下优点：易于配方、模块化、生物相容性以及较大的有效载荷能力。LNPs由可电离的脂质，胆固醇，辅助脂质和聚乙二醇（PEG）组成的颗粒，包装并保护脆弱的mRNA使其不被降解，并最终将其运送至机体细胞内。
首个用于RNA的递送载体的阳离子脂质体是DOTMA及其类似合成物DOTAP（1989）。之后许多阳离子脂类被陆陆续续开发出来，包括商业上很成功的Lipofectamine。然而阳离子脂质体会引发促凋亡和促炎症反应，人们又转向可离子化脂类。这类脂质体进入血液时呈中性，因此提高了载体的安全性并延长了循环时间。酸性环境下，可离子化脂质体带正电，可招募mRNA并进行装载，形成纳米颗粒。此外，胞内体（endosomes）的酸性环境可促进了脂质体与核内体膜融合，从而释放mRNA到细胞质中。DODAP和DODMA是首个用于RNA递送的可电离脂类。
可电离脂类的另外三种成分，胆固醇、辅助脂质和PEG，也促进了纳米颗粒的形成。胆固醇是一种天然的脂质，通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并且胞在吞过程中协助颗粒与内体膜的融合。辅助脂质通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性，脂质的相变有助于与胞内体的膜融合。辅助脂质的选择既取决于可电离的脂质体，也取决于RNA本身。例如，饱和的辅助性脂质(如DSPC)最擅长传递短RNA(如siRNA)，而不饱和脂类(如DOPE)擅长传递mRNA。而FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2使用的都是DSPC。这可能是因为DSPC的性能优于DOPE，而且DSPC也是之前FDA批准的LNPsiRNA的成分之一。另外其他不饱和可电离脂类，如A6和4a3 - cit71，可以增强囊泡融合；而两性离子脂类，如9A1P9，通过促进相变改善内体逃逸。除了促进膜融合，辅助脂质也影响靶器官的特异性:阳离子脂质可将靶向肝脏的药剂定向到肺，而阴离子脂质则定向到脾脏。
LNPs的聚乙二醇化脂质组分由聚乙二醇(PEG)与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水的PEG可稳定LNP；通过限制脂质融合来调节纳米颗粒大小；通过减少与巨噬细胞的非特异性性作用以增加纳米颗粒半衰期。PEG的分子量和锚定脂质的长度都可以根据疗效、循环时间和免疫细胞摄取的具体情况而优化。PEG的分子量从350到3kDa不等，锚定脂质的尾长从10到18个C不等。较大分子量和较长尾长会延长纳米颗粒的循环时间，并减少免疫细胞的摄取。mRNA-1273和BNT162b2（SARS-CoV-2疫苗）PEG分子量为2kD和的饱和锚定脂质尾长为13/14个C。
聚合物具有与脂类类似的优势。阳离子聚合物将核酸浓缩成各种形状和大小的复合物，可通过内吞作用被细胞吞噬。聚合物从核内体的逃逸机制尚不清楚。聚合物中聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)的研究最为广泛。PEI递送效率极高，但由于电荷密度高致使其毒性大，通常采用低分子量PEI、在配方中加入PEG、偶联环糊精和二硫键以减少毒性。
多肽分子的主链和侧链中的阳离子或两亲胺基团(例如精氨酸) 会与mRNA静电结合并形成纳米复合物，将mRNA传递到细胞中。例如，一个包含arginine-alanine-leucine-alanine (RALA) 重复序列的细胞穿透肽在核内体pH下可改变构象，促进膜上孔的形成并完成内体逃逸。RALA将mRNA传递给树突状细胞以诱导T细胞介导免疫反应。
基于角鲨烯的阳离子纳米乳剂也可传递mRNA。这些纳米乳液以油性角鲨烯为核心组成，以一脂质外壳稳定结构，脂质外壳将mRNA吸附在其表面。诺华的MF59（FDA批准的流感疫苗的佐剂）就是角鲨烯配方。MF59可使注射部位的细胞分泌趋化因子来招募抗原呈递细胞，诱导单核细胞向树突状细胞分化，并通过抗原提呈细胞增强抗原摄取。
mRNA疫苗的生产具备速度快，流程工艺相对简单的优势，即便小型GMP设施也可满足mRNA疫苗的生产，如一个5L生物反应器一次就可以生产约100万剂mRNA疫苗。mRNA疫苗制造过程是主要由RNA的长度、核苷酸、加帽和产品的纯化决定，与序列无关，但是特殊性质的序列或者极端长度会给生产带来困难。
mRNA的GMP生产流程始于DNA模板生产，之后的步骤与实验室合成RNA相同。生产所需的所有原料，包括质粒DNA、噬菌体聚合酶、capping酶和NTPs都有GMP级可溯源的商品化货源。这些原料均为化学合成品或由细菌表达，且无动物成分，这也避免了因细胞培养而产生的安全隐患。
但是以质粒为代表的某些原料因生产规模有限导致生产成本极高，这无疑极大的阻碍了mRNA疫苗的推广，而且随着mRNA疗法的商业化和生产规模的增加，这一问题尤显突出。近十几年来，宜明细胞（Ubrigene）一直专注于临床级GMP质粒的大规模平台化生产工艺开发，致力解决GMP质粒大规模生产的种种难题。
对于整个行业来说，mRNA疫苗走到“前台”，将成为引发药理革命的重要时刻。mRNA技术将可能以更快的速度应用于其他重要领域，特别是癌症治疗。宜明细胞一站式CDMO服务平台将竭诚为mRNA医药企业提供的高品质、低成本的GMP质粒，助力mRNA疫苗以及mRNA技术推动，让更多患者获益。
Ubrigene， Serve with Hearts！
Ref：
1.https://www.nature.com/articles/s41573-021-00283-5
2.https://www.nature.com/articles/nrd.2017.243
3.https://www.nature.com/articles/s41591-021-01377-8
4.https://medlineplus.gov/genetics/understanding/therapy/mrnavaccines/
5.https://www.sciencemag.org/news/2021/07/overlooked-superpower-mrna-vaccines
宜明细胞由国际知名专家打造，专注于临床级病毒载体的开发和生产，服务产品有GMP级AAV、质粒、慢病毒、腺病毒、CAR-T及IND申报资料等。宜明细胞定位于生物与健康产业，全面满足客户的早期药物研发、临床试验、大规模商业化生产的需求，为细胞及基因治疗药物开发企业提供一站式CDMO整体解决方案。