浙大顾臻团队发明“死细胞疗法”，液氮冻死细胞、载药回注体内｜专访
死掉的细胞还能帮助治疗急性骨髓性白血病(AML)？据了解，基于 AML 癌变细胞本身“骨髓归巢”这一特点，这种“死细胞”能够运载着药物直达骨髓，也就是说，比传统化疗药物使用更加精准，并可减低复发风险。
这是浙江大学顾臻教授的团队研究出的一种用于 AML 的全新疗法，其巧妙的药物递送方法让人听闻后眼前一亮。相关论文也于 12 月 11 日登上《科学》子刊《Science Advances》的封面。
图｜《Science Advances》当期封面
那死细胞是怎么传递药物的呢？
简单来说，首先需要从患者体内提取出肿瘤细胞，再利用液氮在体外将肿瘤细胞“冻死”，随后在含有死细胞的溶液中加入治癌药物，比如阿霉素。如此，搭载药物的“死细胞”就制备好了。
图｜死细胞制备流程图
最后，再将这些载药死细胞以静脉注射的方式注射到患者体内即可。这就是一次完整的治疗过程。
方法虽好，不过离临床试验还有一段距离，上述实验的研究对象也都是小鼠。DeepTech 向顾臻教授了解到，该团队很快就会在其它动物模型上进行实验，以进一步发掘其临床应用前景。
也许有人会好奇，被液氮冻死的细胞结构不会被破坏吗？这些细胞是否还会继续增殖，又是否具有致病性呢？
载药死细胞成功“归巢骨髓”，显著延长小鼠存活期
顾臻教授团队在《科学》子刊《Science Advances》上发表的这篇文章题为 Cryo-shocked cancer cells for targeted drug delivery and vaccination，论文第一作者为上海中医药大学中药学院副教授慈天元博士及浙江大学药学院特聘研究员李洪军博士。
图｜刊登在《Science Advances》上的相关论文
基于 AML 癌变细胞本身“骨髓归巢”这一特点，该团队提出利用经液氮处理的 AML 细胞的“死细胞”构建具有骨髓靶向功能的递药系统，以提高化疗药物在骨髓内的富集、抑制 AML 细胞的增殖。
同时借助 AML“死细胞”本身所携带的肿瘤相关抗原，联合免疫佐剂，刺激机体对 AML 癌细胞的特异性识别及杀伤。团队在小鼠模型上，验证了该平台技术可联合化疗及免疫治疗有效抑制肿瘤发展、提升生存率。
那么，回到前面的问题，被液氮冻死的细胞不会支离破碎吗？答案是：不会。
在论文中，作者证实了死细胞具有与活细胞类似的细胞结构。不过，实际上这一结论证实起来并不容易。
顾臻告诉 DeepTech，这的确是当时团队攻克的一道难点。因为既要保证细胞彻底被“冻死”、不会复苏，又要让细胞尽可能保持完整的结构，在冷冻方式上着实难以把握。
经过反复实验，该团队终于得出结论，将 AML 细胞分散于特定的细胞冻存液并快速浸没于液氮中 12 小时，然后在 37℃ 的温水中快速解冻，经过液氮处理(liquid nitrogen-treated, LNT)的细胞就能“死得其所”。
如下图所示，细胞虽死，却有着相对完整的细胞骨架与细胞核。这不就可以成功“混入”活细胞的队列中了。
图｜死细胞的结构表征：激光共聚焦显微镜（左），扫描电子显微镜（右）
由此表明，LNT 细胞具有与活细胞类似的细胞结构。
但是接下来还需要评估 LNT 细胞的细胞活力，以验证其在体内没有致病性。对此，研究人员做了以下实验，证实了与活细胞相比，LNT 细胞没有表现出增殖活性，可作为化疗药物如阿霉素的递药载体。
图｜图 G 为用 CCK8 法对活细胞和 LNT 细胞进行的细胞活力分析；图 H 为用荧光素酶标记的活细胞和 LNT 细胞在体内的增殖情况
研究人员进一步证实死细胞具有与源细胞类似的蛋白表达，例如 AML 细胞株 C1498 的死细胞同样携带 CD44 及 CXCR4 两种与骨髓靶向密切相关的抗原，在一定程度上保留了 AML 活细胞的“骨髓归巢”功能。
经 C1498 死细胞包载的阿霉素，与游离药物相比具有更长的血液半衰期及更高的骨髓富集，与免疫佐剂联用后，可显著延长 AML 小鼠的生存期。
图｜载药 LNT 肿瘤细胞联合免疫佐剂显著延长荷瘤小鼠存活率（G1: 生理盐水; G2：阿霉素；G3：死细胞+免疫佐剂；G4：阿霉素/死细胞+免疫佐剂）
由此可见，该平台技术可联合化疗及免疫治疗有效抑制肿瘤发展、提升生存率。
那么，这项新疗法到底强在哪里？
既有靶向性，又有“疫苗”效应
了解这项新疗法之前，首先需要了解一下什么是急性髓性白血病(AML)。AML 是一种髓系造血干细胞癌变的恶性疾病，表现为无法成熟的髓系癌细胞在骨髓内大量增殖、聚集，导致骨髓正常的造血功能被抑制及其它生理机能的病变。
骨髓移植是治疗 AML 的理想方法，但干细胞来源、数量、配型以及移植后的免疫排斥反应等众多问题往往限制了其广泛应用。化疗是除骨髓移植外，AML 最为重要的治疗手段之一，但化疗愈后差、复发率高，五年生存期仅为 30%。
也就是说，常规化疗很难清除骨髓里面的一些癌细胞，并且毒副作用明显。而顾臻团队的这种靶向性更强的疗法，理论上讲相比传统的化疗可抑制复发。
顾臻教授对 DeepTech 说，“我们实际上就是通过这样的方式直接用作 AML 的治疗。一方面可以把化疗的效果进一步增强；另一方面能够进一步刺激机体免疫，降低化疗过后潜在的复发风险。”
简而言之，从理论上讲，采用这种“死细胞递药”的方式，可以为患者争取更多的时间来采取进一步的治疗，而且毒副作用较小。
顾臻教授也向 DeepTech 透露，除了细胞具有靶向功能这一天然优势外，它还拥有较好的生物相容性（生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能），因为“细胞本身就来源于体内”。
由此可见，相比合成材料制备的一些递药体系，以自身的细胞作为药物载体具有一定优势。
另外，类比其他细胞疗法，顾教授称，该治疗方案在质量把控上潜在相对容易一些。“因为常规的细胞疗法需要取活的细胞，所以怎样保证批次与批次之间的活性相仿，就需要一些非常细致标准的验证。”“现在这个细胞是死的，所以相对来说在质量控制上面，难度或许会小一些。”
“自身细胞递药”这个平台未来可期
据了解，接下来研究人员将对“死细胞疗法”的抗癌有效性和安全性在动物模型上做进一步的系统评估，并与企业合作，推动该创新技术临床转化的进程。
在这项研究中，递送的药物是一种经典的化疗药物阿霉素，当然这只是作为一种药物模型进行的实验。顾教授表示，未来也可以换作其他的抗癌药物，或者一些大分子药物，包括抗体类的药物等都可以进行尝试或组合尝试，比如可以把一种药物渗透到死细胞内部，一种药物放在细胞的表面，起到一个协同作用。
此外，DeepTech 也向顾臻教授了解到，团队正在拓展“利用液氮高效制备死细胞”的这一平台技术，有望用于其他疾病的治疗，比如一些实体瘤的相关治疗。
图｜顾臻教授（右）与团队成员
“我们强调的实际上是一个平台技术，通过很简易的操作流程，可以把细胞冻死。但是细胞的形态还在，这样一方面我们可以用作载药，一方面细胞表面蛋白，比如抗原的活性还能够保留下来，那么如果用作肿瘤治疗的话，也能够起到一个疫苗的作用。”顾教授告诉 DeepTech。
其实早在两年前，顾臻教授的团队就研究出一种“联合细胞药物递送”的 AML 治疗方法，将药物“搭载”在血小板上，再将血小板与造血干细胞相结合来递药。
相较于之前的研究，顾臻教授直言，“这次的设计相对简单一些，直接用一种细胞就可以把药物递送过去。”在药物模型的选择方面，也与此前的研究不同，上次用到的是抗体药物，而这次的阿霉素属于小分子。
最后，顾臻教授表示出对“自身细胞递药”这种平台技术的期待，并持以乐观的态度。事实上，近年来顾教授的团队也在充分探寻我们体内一些细胞具备的靶向功能，除了血小板、造血干细胞，甚至还研究过把抗癌药载入脂肪细胞的油滴里来高效递送药物。
尽管从创新研发到投产还有很长一段路要走，顾教授也表示一直在努力推进，想办法转化。如他所言：“我认为在药物递送平台设计上面，可以做的事情特别多。而且从转化这个角度来讲，因为这些冻死的细胞都源于体内，副作用小，并且在量产、质控方面有潜在的优势。”
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