Nature综述：寡核苷酸疗法，未来可期
寡核苷酸通常是由20个以内短链核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）组成，可以通过Watson-Crick碱基互补配对原理与DNA、mRNA或者pre-mRNA配对而实现非常高的选择性，精准地抑制某些基因，让编码异常的基因保持“沉默”，从而阻止许多“错误”的蛋白质表达。
虽然大多数的寡核苷酸疗法都专注于基因沉默，但是其他包括剪接调节和基因激活等策略也正在推进中，这将可能的治疗靶点范围扩大到常规药物治疗的范围之外。
目前在研的寡核苷酸药物种类很多，包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）、核酸适配体（aptamer）等。
截至2020年1月，10种寡核苷酸药物已获FDA批准（表1；图1）。然而，阻碍寡核苷酸疗法广泛应用的一个主要障碍是难以有效地将其输送到肝脏以外的靶器官和组织。此外，还必须仔细考虑脱靶干扰、序列和化学依赖性毒性等。
图1. FDA批准的寡核苷酸药物的化学构成（图片来源：Nature reviews drug discovery）
改进核酸药物递送最常用的策略包括化学修饰改善“类药性”、共价结合到靶向或穿透细胞的单位以及纳米颗粒制剂上。最近开发的方法，如内源性囊泡（即外泌体）装载、球型核酸、纳米技术应用（如DNA笼）和“智能”材料等也在不断推进中。
8月11日，牛津大学和麻省理工学院的科学家们在Nature reviews drug discovery上发表了一篇综述，重点介绍了寡核苷酸药物递送改进方面的最新进展。以下为摘编内容。
递送挑战
将寡核苷酸疗法有效递送到多种组织中仍然是一个主要的挑战。寡核苷酸通常是大的亲水性多聚阴离子（单链ASO约为4–10 kDa，双链siRNA约为14 kDa），这种特性意味着它们不容易通过质膜。
在活性方面，系统注射的核酸药物必须抵抗细胞外间隙的核酸酶降解，绕过肾脏清除，穿过毛细血管内皮，通过细胞旁或跨细胞通路到达器官/组织内的靶细胞，并穿过质膜，在溶酶体降解或通过胞吐被重新排出之前逃离内溶酶体系统，到达正确的细胞内作用部位。
通过系统递送到达中枢神经系统（CNS）是一个额外的障碍，因为基于寡核苷酸的疗法通常不能穿过血脑屏障。不过，经腰椎穿刺直接注入脑脊液的寡核苷酸（如nusinersen）已被证明可使治疗分子在中枢神经系统得到良好的分布。
到目前为止，大多数寡核苷酸疗法（以及几乎所有已获批的核酸药物）都集中在局部给药（例如，眼睛或脊髓）或对肝脏的递送。眼睛是一个免疫特权器官，这使得它一直是基因和寡核苷酸疗法（例如，pegaptanib和fomivirsen）选择的解剖学靶组织。肝脏具有不连续的肝窦内皮，这意味着在肾脏清除前能迅速摄取游离寡核苷酸和更大的纳米粒。肝脏还含有高浓度的受体（例如，清道夫受体和去唾液酸糖蛋白受体），这些受体可促进摄取和/或迅速再循环。尽管其他具有不连续或有窗孔内皮的高度血管化组织，如肾脏和脾脏，也是寡核苷酸积累的场所，但开发有效的肝外系统输送技术仍是寡核苷酸治疗领域的主要目标。
改进递送的方法
化学修饰
化学修饰是增强寡核苷酸药物递送的最有效途径之一。核酸主链、核糖的糖部分和核碱基的修饰已被广泛应用，以改善寡核苷酸药物的类药性，从而提高药物的递送能力（图2）。
图2. 寡核苷酸药物中常用的化学修饰。包含一个RNA核苷酸的示意图，以及它如何在主链、碱基、核糖糖和2ʹ-核糖取代处进行化学修饰。B = 核碱基; cEt = constrained ethylbridged nucleic acid; ENA = ethylene-bridgednucleic acid; 2ʹ-F = 2ʹ-氟; LNA = 锁核酸; 2ʹ-MOE = 2ʹ-O-methoxyethyl; 2ʹ-OMe = 2ʹ-O-methyl; PMO = 二酰胺吗啉代寡核苷酸; PNA = 肽核酸; PS = 硫代磷酸酯; tcDNA = 三环DNA。（图片来源：Nature reviews drug discovery）
具体来说，修饰被用来改善寡核苷酸的药代动力学、药效学和生物分布。某些治疗方式的功能也需要特定的修饰模式（例如gapmers）。第二代gapmer ASO的大量化学修饰足以使其输送到各种组织，而无需额外的递送剂。
此外，在迄今批准的10种寡核苷酸疗法中（表1），有8种是“裸的”（即缺乏额外的运载工具），仅依靠化学修饰来促进其组织递送。目前由Ionis Pharmaceuticals开发的gapmer ASO，包括治疗肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、中央核性肌病，尤其是亨廷顿病的药物也是如此（表2）。这些结果证明了化学修饰的重要性。
生物偶联技术
ASO和siRNA的递送潜力可以通过直接共价结合可促进胞内吸收的不同“元件”来增强，以将药物靶向特定的细胞/组织或减少循环中的药物清除。这些“元件”包括脂质（例如，促进与循环中脂蛋白颗粒相互作用的胆固醇）、肽（用于细胞靶向和/或细胞穿透）、适体、抗体和糖（如N-乙酰半乳糖胺，GalNAc）。
生物结合物构成明确的同种单组分的分子实体，具有精确的化学计量，这意味着大规模合成相对简单，并且它们的药代动力学特性明确。此外，相对于纳米颗粒方法（下文讨论），生物结合物往往是小型的，这意味着它们通常表现出良好的生物分布特征，因为能够到达那些具有不连续或有窗孔内皮组织之外的组织中。
寡核苷酸生物结合方法的共同主旨是促进结合物与其相应的细胞表面受体蛋白之间的相互作用，导致随后通过受体介导的内吞作用内化，将药物靶向递送到特定组织或组织内的特定类型细胞。
纳米载体技术
纳米技术和材料科学的发展为解决寡核苷酸药物递送的挑战提供了优势和潜在的解决方案，尤其是针对跨越生物屏障和跨膜细胞内递送的要求。纳米颗粒给药系统的主要优点包括对纳米颗粒的生物物理学（例如，尺寸、形状和化学/材料成分）和生物学特性（例如，靶向配体功能化）进行定制优化，从而实现高度定制的递送平台。
用于核酸药物递送的多种纳米载体正处于不同的发展阶段，包括与阳离子聚合物（例如，聚乙烯亚胺）、树枝状大分子、细胞穿透肽（如MPG-8、PepFect6、RVG-9R和Xentry-KALA），以及无机方法（例如，磷酸钙纳米颗粒）非共价络合。下面将重点介绍用于寡核苷酸递送的基于脂质的制剂，以及包括内源性外泌体、球型核酸和自组装DNA纳米结构等的新兴方法。
基于脂质的制剂
脂质制剂是增强核酸递送的最常见方法之一。例如，一些脂质纳米颗粒（LNP，也被称为稳定的核酸脂质颗粒）是含有可电离脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-脂质结合物的脂质体，已成功地用于多种疾病。具有里程碑意义的例子是近两年patisiran的批准。
LNP的一个缺点是它们的递送主要局限于肝脏和网状内皮系统，因为该组织中的窦状毛细血管上皮提供足够大的空间，允许这些相对较大的纳米颗粒进入。不过大尺寸的纳米颗粒也有益处，因为它基本上排除了肾脏过滤，并允许输送更高的有效载荷。
LNP可通过肽、聚乙二醇或其他具有细胞特异性靶向的配体【例如，GalNAc（肝细胞）、anisamide（肺肿瘤）、strophanthidin（各种肿瘤）和维生素A（肝星状细胞）】进一步功能化。值得注意的是，LNP复杂性的增加使其制造复杂化，并可能增加其毒性，这是一个可能限制其临床应用的主要问题。例如，LNP siRNA颗粒（如patisiran）需要预先用类固醇和抗组胺药物来消除不必要的免疫反应。
外泌体
外泌体是一种异质性脂质双层囊泡，直径约为100nm。外泌体被细胞释放到细胞外空间，并通过转移复杂的大分子货物（即核酸、蛋白质和脂类）促进细胞间的通讯。
在寡核苷酸药物递送方面，外泌体具有许多优点：1）能够穿过生物膜，如血脑屏障；2）无毒，已被安全应用于移植物抗宿主病患者；3）有可能以自体方式产生；4）某些来源的外泌体已被证明具有固有的促再生和抗炎特性，可增强寡核苷酸治疗效果；5）工程化的外泌体可以作为一个模块化的平台，借此可以部署治疗和/或靶向“元件”的组合。
大规模生产治疗性外泌体（包括临床级）的方法已被报道。利用具有永生潜力的间充质干细胞系在生物反应器中进行培养，可以产生大量含有外泌体的条件培养基。随后利用尺寸排阻液相色谱等方法将治疗性外泌体从上清液中分离出来。目前Codiak Biosciences 和Evox Therapeutics这两个公司的工程外泌体技术的治疗应用正处于后期临床前阶段。
球型核酸
球型核酸颗粒由亲水性寡核苷酸（例如ASO、siRNA和免疫刺激性寡核苷酸）覆盖的疏水性核心纳米颗粒（包括金、二氧化硅或各种其他材料）组成，这些寡核苷酸通过巯基键紧密地堆积在核心纳米颗粒表面（图4h）。与其他纳米颗粒设计不同，球型核酸颗粒中的寡核苷酸从核心结构向外辐射。尽管暴露在外，由于空间位阻、局部高盐浓度以及通过与蛋白冠的相互作用，寡核苷酸在一定程度上不受溶核降解的影响。目前，Exicure公司正在将球型核酸颗粒商业化，应用于寡核苷酸递送。
DNA纳米结构
DNA纳米结构有很多种，也被用于寡核苷酸的递送。这些结构包括DNA折纸术，即长DNA分子通过短DNA“订书钉”固定在特定的结构中，从而形成各种各样的复杂形状，包括多边形纳米结构，如DNA笼。DNA纳米结构的物理特性（例如，尺寸、柔韧性和形状）可以微调，以最大限度地发挥其递送潜力。
此外，DNA纳米结构的一个非常有趣的特性是它们不会在肝脏中积聚，并且可以被设计成小尺寸（约20 nm），这意味着它们可以进行肝外递送。然而，进一步缩小DNA纳米结构的尺寸而不进行额外的功能优化可能会导致肾脏滤过功能增强，整体生物利用度降低。
刺激-响应纳米技术
刺激敏感、可激活的药物递送纳米技术正在成为寡核苷酸递送方案。例如，一种由PBAVE支架聚合物组成的siRNA动态多聚共轭物，通过酸不稳定的连接物连接到PEG和N-乙酰葡糖胺（肝靶向）部分，在静脉给药后诱导小鼠肝细胞中诱导有效的基因沉默。具体来说，内体的酸性环境诱导PEG和N-乙酰葡糖胺基团断裂，导致PBAVE叔胺暴露，缓冲luminal pH值，使内体逃逸。
甚至更复杂的“智能”递送工具也可以通过DNA纳米技术实现。例如，DNA折纸术已经被用来产生一个盒子，这个盒子被打开并结合两个结构变化的适体“锁”。当两个适体与它们的目标蛋白相互作用时，锁打开，DNA盒改变构象释放其内容物。这项技术被用于递送金纳米颗粒和抗体片段，但也可能被调整用于核酸递送。这种逻辑门控递送工具具有许多优点，因为治疗性有效载荷可以集中在所需的作用部位，从而提高疗效并减少脱靶效应。
思考和展望
建立能够将寡核苷酸药物递送到特定器官或组织的治疗平台可能涉及明确的化学修饰模式、可预测药代动力学和药效学特性的偶联/络合策略，以及清楚的作用机制。借此，寡核苷酸疗法有潜力扩大可能的药物靶点范围，并提供使新药能够迅速开发，以满足尚未实现和正在出现的临床需求的方法。
此外，尽管LNP和GalNAc结合物在临床前和临床研究中提供了良好的肝脏递送，但肝脏以外的系统性递送仍需要进一步的研究、创新和发展。在许多情况下，经批准的寡核苷酸药物很可能极其昂贵，令人望而却步。例如，nusinersen第一年的费用为75万美元，随后几年的费用为37.5万美元。eteplirsen每年的费用为30万美元。
像nusinersen这样的高效、改变生活的药物性价比值得支持。相比之下，疗效有限的etplersen的性价比则没有说服力。随着寡核苷酸疗法与新型给药方式的进一步结合，这些进展可能会增加材料成本。然而，新型给药技术提供了更高的疗效和/或更好的靶向性意味着给药剂量可以降低，这可能反过来降低成本。
另一个关键的考虑因素是安全性。虽然人们对标准核酸修饰化学制剂的免疫刺激特性已经有了较为深入的了解，但递送剂成分或配体结合物的潜在免疫原性可能对安全有效的寡核苷酸药物递送提出额外的挑战。考虑到大量的核酸化学、递送技术和治疗方式，在许多情况下不太可能进行直接的头对头比较。人工智能和计算机建模的应用可能是解决这些问题的一种方法。
最近，许多备受瞩目的监管机构的批准表明，寡核苷酸药物递送已经成熟到可作为多种不同适应症的临床应用。核酸化学修饰、与细胞/组织靶向配体的结合以及纳米颗粒载体系统的高度优化组合提高了寡核苷酸药物递送的效率，并/或使治疗分子能够到达先前无法企及的靶组织。这些进展为许多罕见或目前无法治疗的疾病提供了新的希望。
参考资料：
Thomas C. Roberts et al. Advances inoligonucleotide drug delivery. Nature reviews Drug Discovery (2020).
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