越来越多的证据表明肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和外泌体在转移前niche（生态位）形成中发挥重要作用。TAMs是转移前生态位形成和结直肠癌肝转移(CRLM)的基础。然而，肿瘤来源的外泌体miRNAs与TAMs相互作用的分子机制仍然很大程度上未知。本研究发现肿瘤来源外泌体miR-934可以诱导巨噬细胞M2极化，进而促进CRC的肝转移。该文于2020年11月发表在《Journal of Hematology and Oncology》IF：11.059期刊上。
1、miR-934表达升高与CRLM进展及预后不良呈正相关为了揭示参与CRLM的miRNA，作者基于TCGA数据库比较了CRC的1期肿瘤和4期肿瘤的miRNA表达谱，发现miR-934是在4期肿瘤中高表达差异表达最显著的miRNA（Fig. 1a,b）。此外，作者将110个CRC组织按有无肝转移分为两组，发现肝转移组与未转移组相比，组织和血清miR-934表达上调（Fig.1c, d）。接下来，为了研究miR-934在CRLM进展中的作用，使用ISH比较了miR-934在包含308个CRC样本的组织芯片(TMA)中的表达，与正常粘膜组织相比，CRC组织中miR-934的表达明显上调;miR-934表达增加与T分期、M分期、晚期AJCC分期和肿瘤复发呈正相关，尤其是在肝转移的病例中（Fig. 1e）。以上数据提示，miR-934异常高表达与结直肠癌肿瘤进展及肝转移显著相关。生存分析显示，与miR-934表达较低的患者相比，miR-934表达较高的患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)较低（Fig. 1f, g）。因此，在CRLM患者中，miR-934高表达与CRLM进展和预后不良呈正相关。图1 miR-934表达升高与CRLM进展及预后不良呈正相关miR-934在HCT-8和LoVo的CM中的表达显著高于其它细胞（Fig. 2a）。随后，研究发现HCT-8和LoVo的CM中miR-934的表达显著高于细胞核和细胞质（Fig. 2b, c）。并且，miR-934在CM中的表达不随RNase A的处理而改变，而随RNase A Triton X-100的处理显著下降（Fig. 2d），这表明细胞外的miR-934被膜包裹，而不是直接分泌。因此，推测miR-934可能是被外泌体传输。电镜和纳米颗粒追踪分析表明，miR-934表达水平较高的CRC细胞分泌的外泌体比miR-934表达水平较低的CRC细胞分泌的外泌体更多（Fig. 2e, f）。各组外泌体标志物CD9，ALIX，TSG101均被WB检测到（Fig. 2g）。为了阐明miR-934是否主要来源于CRC细胞的外泌体，使用GW4869抑制CRC细胞的外泌体分泌，发现miR-934在CRC细胞来源的外泌体中的表达水平明显高于外泌体耗尽的CRC细胞（Fig. 2h）。此外，采用qPCR分析miR-934在总CM、外泌体耗尽CM(超离心耗竭)和外泌体中的表达，结果显示，miR-934在总CM或外泌体中的表达显著高于外泌体缺失的CM（Fig. 2i）。此外，使用qPCR研究了上述四种CRC细胞系的外泌体中miR-934的表达，发现外泌体中miR-934的表达模式与CRC细胞CM中的表达模式一致（Fig. 2j）。以上结果表明miR-934主要包裹在CRC细胞来源的外泌体中。图2 miR-934存在于CRC细胞衍生的外泌体中3、CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导巨噬细胞M2极化为了探索miR-934促进CRLM的分子和细胞基础，通过Cytoscape软件注释了TCGA cohort中191个miR-934相关基因的细胞功能，发现miR-934广泛参与多种炎症反应，提示miR-934可能参与了CRC免疫微环境（Fig. 3a）。然后发现miR-934与巨噬细胞的基因信号特异性相关（Fig. 3b）。为了研究在CRLM中TAM的浸润与miR-934之间的相关性，我们在原发性结直肠癌组织和CRLM组织样本中采用免疫组化染色检测TAM标记CD163。如图3c所示，在CRLM组织中CD163 TAM浸润丰富的区域观察到miR-934表达升高。将THP-1细胞与PMA孵育，诱导分化为M0巨噬细胞，M0巨噬细胞具有适当的贴壁形态和巨噬细胞标志物CD68的高表达（Fig. 3d）。接下来，研究了CRC细胞来源的外泌体对巨噬细胞M2极化的影响。如Fig. 3e所示，当与巨噬细胞共培养时，标记有DiO(绿色)的CRC细胞来源的外泌体被未染色的巨噬细胞内化。相比于低表达miR-934的细胞的外泌体孵育的巨噬细胞或PBS孵育的细胞，M2标记物 (CD206, arginase-1, IL10和CD163)的表达在高表达miR-934的CRC细胞的外泌体孵育的巨噬细胞中显著增加，而M1标记物(iNOS和IL-1β)几乎无差异（Fig. 3f, g）。为了确定CRC细胞来源的外泌体miR-934是否诱导巨噬细胞的M2极化，首先生成了miR-934 mimics和anti-miR-934来过表达或抑制miR-934的表达。与对照组相比，转染miR-934 mimics的巨噬细胞M2标记物(CD163、CD206、arginase-1和IL10)的表达明显增加（Fig. 3h, i）。此外，用anti-miR-934、miR-934 mimics或其阴性对照载体转染HCT-8和HT29细胞，提取其外泌体并添加到PMA处理的THP-1细胞中。结果显示，转染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC细胞的外泌体中M2标记物(CD206、arginase-1、IL10和CD163)在PMA处理的THP-1细胞中表达明显低于或高于载体对照组（Fig. 3j, k）。综上所述，证实CRC细胞来源的外泌体miR-934可以诱导巨噬细胞M2极化。图3 CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导巨噬细胞M2极化4、hnRNPA2B1在外泌体miR-934向巨噬细胞转移中发挥作用据报道，外泌体RNA的分泌需要一种特定的RNA结合蛋白来转运。通过RNA pull-down分析和质谱分析，鉴定了三种可能参与miR-934转运的RNA结合蛋白，并发现敲除hnRNPA2B1可以降低外泌体miR-934的表达（Fig. 4a, b）。hnRNPA2B1是一种RNA结合蛋白，通过与特定基序GGAG/CCCU结合，参与miRNAs的运输和转录后调控。特别是，由于miR-934序列中有两个GGAG基序，我们推测hnRNPA2B1可能通过与GGAG序列结合，介导miR-934包装成外泌体的过程。此外，miRNA pull-down分析显示，在细胞质和外泌体中，miR-934和hnRNPA2B1之间存在显著的结合关系，然而，突变miR-934的结合序列(GGAG)可削弱这种结合（Fig. 4c）。RNA免疫沉淀分析进一步证明，无论是在CRC细胞及其外泌体裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗体组中比在anti-IgG抗体组中更显著富集（Fig. 4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌体miR-934从HCT8和LoVo细胞转移到巨噬细胞的过程（Fig. 4e）。因此，这些结果证实hnRNPA2B1可以通过与miR-934的GGAG序列结合，介导miR-934包装到CRC细胞外泌体中，并将外泌体miR-934转移到巨噬细胞中。图4 hnRNPA2B1在外泌体miR-934向巨噬细胞转移中发挥作用5、外泌体miR-934通过下调PTEN表达和激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞M2极化进一步探索肿瘤来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化的机制。miR-934序列与PTEN的3 ' -UTR序列存在比对，提示miR-934可能靶向PTEN诱导M2巨噬细胞极化（Fig. 5a）。如Fig.5b所示，将miR-934 mimics或anti-miR-934及其控制载体转染到PMA处理的THP-1细胞中，发现分别转染miR-934 mimics或anti-miR-934和PTEN野生型结合位点组中PTEN的3’-UTR荧光素酶活性显著降低或升高（Fig. 5b）。有趣的是，当细胞与转染了anti-miR-934、miR-934 mimics或其对照载体的HCT-8或HT29细胞的外泌体共培养时，荧光素酶活性模式显示出与上述趋势相同（Fig. 5c）。此外，PMA处理的THP-1细胞转染miR-934 mimics或anti-miR-934，与各自的对照细胞相比，分别在mRNA和蛋白水平下调或上调了PTEN的表达（Fig. 5d）。类似的，分别用转染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC细胞的外泌体孵育PMA处理的THP-1细胞，结果发现PTEN，PI3K/AKT的表达明显高于或低于各自的对照组（Fig. 5e, f）。这些表明在PMA处理的THP-1细胞中，外泌体来源的miR-934可以通过靶向其3 ' -UTR和激活PI3K/AKT通路来下调PTEN的表达。IL-3/IL-4能诱导M2巨噬细胞极化，预先用50ng /mL IL-3/IL-4处理THP-1细胞3天，验证anti-miR-934对M2巨噬细胞极化的影响。结果显示PTEN过表达部分减弱了miR-934和HCT-8细胞来源外泌体对M2标记物(CD206, arginase-1和IL10)表达的增强作用，而PTEN的沉默则相应地逆转了anti-miR-934对M2标记物表达的衰减效应（Fig. 5g, i）。流式细胞术检测M2巨噬细胞标志物CD163在PMA处理的THP-1细胞中的表达，结果与上述结果一致（Fig. 5j）。总之，研究结果表明，miR-934增强了CRC细胞来源的外泌体对M2巨噬细胞极化诱导的增强作用，而anti-miR-934减弱了其增强作用。PTEN是一种肿瘤抑制因子，调节多种细胞功能，包括细胞增殖和分化，PI3K/AKT信号通路是PTEN通过其磷酸酶活性靶向的最重要通路之一。因此，推测PI3K/AKT信号通路可能参与CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化。WB结果显示过表达PTEN可以部分减弱miR-934和HCT-8细胞源外泌体对p-AKT和p-PI3K表达的增强作用，而沉默PTEN则相反（Fig. 5k）。更重要的是，当与HCT-8细胞来源的外泌体和PI3K抑制剂(LY294002)共培养时，PMA处理的THP-1细胞中p-AKT和M2标记物(CD206、arginase-1和CD163)的表达下调（Fig. 5l, m）。综上所述，CRC细胞来源的外泌体miR-934可以通过下调PTEN表达和激活PI3K/AKT信号通路诱导M2巨噬细胞极化。图5外泌体miR-934通过下调PTEN表达和激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞M2极化6、CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化促进CRLM将弱转移的CRC细胞系SW480和RKO与miR-934 mimics预处理的THP-1细胞的CM共培养。结果显示，无论是体内还是体外，侵袭和转移能力都随着miR-934 mimics外泌体处理而升高，随着anti-miR-934外泌体处理而下降（Fig. 6c–g）。这些结果表明，CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化可以增强CRC细胞的侵袭和肝转移能力。图6 CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化促进CRLM7、CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化，通过激活CRC细胞中的CXCL13/CXCR5轴促进CRLM用HCT-8细胞来源的外泌体与阴性对照处理或PMA预处理的THP-1细胞孵育，分析趋化因子水平。如Fig.7a所示，CXCL13、IL-10和CCL22的表达水平远远高于其他趋化因子的水平。然后，PMA-pretreated THP-1细胞转染miR-934 mimics或NC，ELISA表明CXCL13的表达显著增加(大约10倍)而CCL22和IL - 10(二至三倍)，这表明CXCL13可能在CRLM的进展扮演了一个重要的角色（Fig. 7b）。此外，结果显示，过表达miR-934或下调miR-934可部分增强或减弱HT29/HCT8细胞来源外泌体对M2巨噬细胞分泌CXCL13的增强作用（Fig. 7c）。因为CXCL13是一种趋化剂，可以促进表达CXCR5的细胞趋化，使用IHC染色评估其在CRC中的表达，结果显示CXCR-5在结直肠癌组织中的染色强于正常组织，说明M2极化巨噬细胞分泌的CXCL13主要作用于CRC细胞（Fig. 7d）。PMA预处理后的THP-1细胞转染miR-934 mimics，并与加入anti-CXCL13抗体或IgG的SW480细胞或RKO细胞共培养。此外，上述TPH-1细胞液与敲除CXCR5的细胞共培养。体外transwell实验显示，在与miR-934过表达PMA处理的THP-1细胞的CM共培养组中，anti-CXCL13抗体抑制了CRC细胞的迁移和侵袭；转染了shCXCR5的SW480和RKO细胞与miR-934过表达PMA处理的THP-1细胞共培养时，迁移和侵袭能力降低（Fig. 7e, f）。此外，小鼠体内肝转移检测表明，与对照组相比，用anti-CXCL13抗体或敲除CXCR5的CRC细胞的肝转移菌落减少（Fig. 7g–i）。图7 CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导M2巨噬细胞极化，通过激活CRC细胞中的CXCL13/CXCR5轴促进CRLM8、CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反馈环路在CRLM期间介导M2巨噬细胞和CRC细胞之间的相互作用如Fig. 8a所示，WB显示，与对照组相比，SW480和RKO细胞中，CXCL13促进p65磷酸化，NFκB、MMP2和MMP9的表达上调而IκBα的表达下调。CXCR5表达下调可部分减弱CXCL13的增强作用。此外，PMA处理的THP-1细胞用miR-934 mimics预处理，然后与SW480细胞或RKO细胞与anti-CXCL13抗体共培养，或与shCXCR5共培养。我们发现CRC细胞中的anti-CXCL13抗体或CXCR5敲低可以抑制miR-934过表达诱导的NFκB信号通路的活化（Fig. 8b）。值得注意的是，helenalin抑制NFκB/p65信号后，SW480和RKO细胞中miR-934、MMP2和MMP9的表达显著低于对照组（Fig. 8c），这表明miR-934也可能通过正反馈回路被NFκB/p65信号正调控。由于p65转位到细胞核并促进其靶向基因的转录，假设NFκB/p65信号通路的激活可通过p65的转录活性上调miR-934表达。在p65和miR-934启动子之间发现了5个潜在的转录结合区域和2个特异性结合位点（Fig. 8d）。随后，用miR-934启动子中含有p65结合区域的载体转染SW480和RKO细胞；ChIP实验证明p65对miR-934的转录在-2002和-1500 bp（区域1）之间的区域内显著增高，在其他四个结合区域中未观察到明显变化（Fig. 8e）。这些数据表明，区域1可能在调节CRC细胞中p65介导的miR-934转录诱导中起关键作用。荧光素酶报告基因检测证实p65对SW480和RKO细胞中miR-934启动子的转录影响（Fig. 8f）。作者发现只有突变结合位点1可以下调p65的荧光素酶报告基因活性，抑制miR-934的转录表达，这证明p65可以通过结合位点1正向直接调节miR-934的表达(Fig.8f)。此外，作者证明了SW480和RKO细胞中的突变结合位点1可以消除CXCL13的促进作用和NFκB/p65信号对miR-934表达的抑制作用(Fig. 8g,h)。综上所述，这些结果证明CXCL13/CXCR5/NFκB/p65信号通路促进CRC细胞中miR-934的转录，形成一个正反馈回路，参与持续的M2巨噬细胞极化和CRC细胞的侵袭和转移。图8 CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反馈环介导M2巨噬细胞与CRC细胞之间的相互作用CRLM总之，如Fig. 9，CRC来源的外泌体miR-934可通过下调PTEN表达和激活PI3K/AKT信号通路诱导M2巨噬细胞极化。此外，外泌体miR-934极化的M2巨噬细胞可以通过CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR934正反馈环促进CRLM。因此，研究阐明了促进肿瘤细胞和TAMs相互作用的CRLM的新分子机制，这将有助于开发CRLM的有效预防和治疗策略。更重要的是，血清外泌体中miR-934高表达与CRLM相关，提示其可能是未来液体活检和预测CRLM风险的一个有前景的生物标志物。此外，靶向外泌体miR-934介导的肿瘤细胞与TAMs之间的串扰可能为CRLM的治疗提供新策略。ZhaoSenlin., Mi Yushuai., Guan Bingjie., Zheng Binbin., Wei Ping., Gu Yanzi., ZhangZhengxiang., Cai Sanjun., Xu Ye., Li Xinxiang., He Xuefeng., Zhong Xinyang., LiGuichao., Chen Zhiyu., Li Dawei.(2020). Tumor-derived exosomal miR-934 inducesmacrophage M2 polarization to promote liver metastasis of colorectal cancer. JHematol Oncol, 13(1), 156. doi:10.1186/s13045-020-00991-2
