基因疗法是通过引入遗传物质（例如治疗性蛋白质的表达系统或校正患病细胞中错误基因的编辑工具）来治疗遗传疾病的一种疗法。该领域的发展为人们带来了希望。以前无法治愈的疾病，例如遗传性疾病、癌症和自身免疫性疾病的治疗。迄今为止，全世界至少进行了943项基因治疗的临床试验。递送对于基因治疗至关重要。细胞膜对带负电的核酸设置不可渗透的屏障。而且，遗传物质在人体内很脆弱，因此必须加以保护才能生效。mRNA和病毒或非病毒质粒DNA通常是基因治疗中使用的遗传物质。例如，腺相关病毒（AAV）载体得到了广泛使用。然而，AAV载体诱导宿主免疫反应，导致载体快速降解或中和，并严重损害了其基因治疗的效率。纳米结构（如外泌体）的封装可保护AAV载体免受宿主免疫系统的侵害，并通过质膜将其递送到细胞中。香港中文大学夏江教授等在Nanoscale杂志发表综述，描述了外泌体作为载体进行封装和将基因载体递送至细胞的过程以及相关的疾病治疗方法（图1）。外泌体作为各种遗传物质的载体的利弊，工程化外泌体以增加负载和递送的策略，最大化基因负载外泌体产量的方法，以及对外泌体介导的靶向基因治疗的未来展望讨论。
根据来源，基因递送载体可分为病毒系统或非病毒系统（图2）。病毒介导的基因递送系统使用复制缺陷的修饰病毒，但可以传递DNA表达，包括腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。传统的非病毒载体包括胶束、脂质体、树状聚合物和碳纳米管。最近，由细胞分泌的细胞外囊泡，特别是外泌体，已被用作基因递送的非病毒载体，并显示出高生物相容性、低清除率和适合细胞靶向传递的特性。杂合基因递送技术，如外泌体-AAV杂交等，将病毒载体与非病毒载体结合使用，并显示出显著降低的免疫原性。该文重点探讨基于病毒囊泡和外泌体的基因递送载体。
外泌体是直径为40-160 nm的脂质双层包裹的囊泡，在细胞外环境中循环。它们起源于晚期内体膜的内部出芽，并且被所有细胞类型释放。因此，外泌体是细胞间通讯的天然载体。然后，此功能诱使研究人员开发基于外泌体的药物递送系统。与其他基因递送系统相比，由于以下原因，外泌体是有利的。首先，外泌体是多功能载体。外泌体可以包裹并递送各种生物货物，例如小RNA、mRNA和蛋白质。第二，外泌体具有穿越生物屏障（例如血脑屏障）的天然能力。它们也可以迁移到没有血液供应的组织或区域，例如致密的软骨基质。此外，在到达目标组织后，外泌体可以在那里停留很长一段时间。清除率低归因于外泌体的生物相容性。另一个重要特征是外泌体可以基因工程改造。通过改造外泌体的表面蛋白可以实现多种目的，例如，可以将靶向细胞或组织的肽附加在外泌体的表面上，以实现针对特定组织的选择性靶向，避免在其他器官中不必要的积累，从而降低全身毒性。研究表明，基于外泌体的靶向基因疗法可以增强治疗功效和安全性。例如，研究人员设计了一种基于外泌体的软骨细胞靶向miRNA递送系统，用于软骨缺损修复。在这项工作中，软骨细胞亲和肽（CAP）在外泌体表面表达，并且miR-140被装载在外泌体内部。与封装在没有表面修饰的外泌体中的miRNA相比，CAP-外泌体/miRNA复合物的关节内注射显示出软骨的选择性和长期富集，并且对软骨缺损的治疗功效显著提高。与外泌体的结合可以减轻毒性并减轻AAV载体的快速清除。AAV载体具有诸如中和体内抗AAV抗体的快速清除和脱靶递送（通常到肝脏）的缺点。Maguire等在2012年证明AAV载体的一部分与微囊泡/外泌体有关。在电子显微镜下，AAV衣壳与微囊泡的表面和内部缔合。从细胞培养基中纯化的与外泌体相关的AAV（Exo-AAV）（图3）在转导效率方面优于常规纯化的AAV载体。AAV载体的一个显著问题是，它会诱导强效的长期体液应答，包括与AAV载体结合并抑制转导的中和抗体（NAb）和标记病毒的非Nabs。因此，NAb会对AAV介导的基因治疗的功效以及AAV载体的分布和安全性产生不利影响。相比之下，与传统AAV相比，exo-AAV对中和抗AAV抗体的抵抗力更高。这已经被实验证明。在体外和体内，与外泌体相关的AAV载体对NAb的抵抗力均高于AAV，在存在和不存在Nabs的情况下，AAV9Exo-SERCA2a在驻留心脏功能方面均优于常规AAV载体。Exo-AAV8基因的递送降低了治疗剂量，并实现了有效的转导。Exo-AAV在中枢神经系统以及听觉和前庭系统中也显示出更高的转导功效。
图3、分别显示生产和纯化Exo-AAV（上部）和单独AAV（下部）的不同程序示意图在CRISPR序列的指导下，Cas9酶可以在细胞中以前所未有的精度、效率和灵活性编辑基因组DNA。但是，离体设计的CRSPR-Cas9系统需要递送到目标细胞和生物中进行基因治疗。CRISPR-Cas9系统的传递可通过物理相互作用、化学修饰和生物载体实现。CRISPR-Cas9系统可通过脂质双分子层中的短暂间隙被输送到细胞中，该间隙由物理方法引起，例如电穿孔、流体动力注射、膜变形等。尽管简单易行，但可能对细胞膜造成不可逆的生理损伤。CAS9-sgRNA的化学修饰还将使它能够传递到细胞，或者诸如噬菌体、病毒和细胞外囊泡等生物载体可以介导CRISPR-Cas系统向细胞的传递（表3）。4.1 外泌体作为CRISPR-Cas9质粒的载体与病毒载体相比，来自某些细胞来源的外泌体可以选择性地将货物递送至肿瘤组织。Kim等报道称癌细胞来源的外泌体可以将CRISPR-Cas9系统转运至靶肿瘤。4.2 用于CRISPR-Cas9递送的工程外泌体天然外泌体并非设计来传递大分子，例如质粒。因此，外泌体中质粒的负荷低。然后需要对外泌体进行工程改造，以提高质粒的效率和容量。工程外泌体还赋予了这些转运纳米颗粒以靶向能力，可将货物转运至特定细胞或组织。在外泌体表面表达的标志蛋白CD63和CD9通常被选作外泌体工程的靶蛋白。外泌体的纳米级尺寸（40–160 nm）使其成为小型治疗剂（例如化合物、siRNA和miRNA）的合格载体。对于大分子，例如最小大小为5–6 kb的CRISPR-Cas9表达质粒，天然外泌体的容量仍然相对较低。另一方面，脂质体能够包封和传递大质粒，但由于脂质的非天然性质，具有较高的细胞毒性。外泌体膜的脂质双层与脂质体的融合形成了外泌体-脂质体杂合体，从而可以包裹和递送大型DNA分子，例如CRISPR-Cas9表达质粒，还减轻了脂质体的毒性问题（图4）。因此，外泌体-脂质体的杂交扩大了外泌体在药物输送中的应用范围。
将大的mRNA转录物封装进外泌体是一项艰巨的任务。尽管天然分泌的外泌体包含多种RNA，包括miRNA、ncRNA和片段，但大多数片段很小。大的mRNA分子可通过电穿孔从红细胞转移至外泌体，但这一过程仍然效率低下。鉴于这一障碍， 杨等提出了一种可大规模产生携带功能性mRNA外泌体的方法（相关报道：Nature子刊：细胞纳米穿孔可大规模产生携带功能性mRNA的外泌体）。这项工作开发了具有约500 nm直径的纳米通道的细胞纳米穿孔生物芯片。作者用质粒DNA转染了细胞，并通过局部和瞬时电刺激刺激了转染的细胞。这种纳米穿孔程序促进了携带转录的mRNA和靶向肽的外泌体从细胞中释放，导致外泌体增加多达50倍，外泌体mRNA转录产物增加了超过103倍，每个外泌体估计可达到2-10个完整的功能性mRNA。通过设计的载体对基因载体进行组织或细胞特异性递送，可以实现具有降低的毒性或风险的基因治疗的高级版本。来自细胞源，外泌体的载体可以介导各种基因治疗分子或载体的递送。特别是，通过外泌体的遗传或化学工程，可以将特异性识别序列安装在外泌体的外部，以指导货物的靶向递送，或者可以通过外泌体标记蛋白来设计蛋白-蛋白相互作用富集靶蛋白。此外，具有核酸结合特性的工程外泌体也将有助于质粒或载体的包封并提高加载效率。将外泌体与脂质体融合将形成囊泡，该囊泡可以封装大质粒或mRNA转录本，同时保留外泌体的优势，例如生物相容性和靶向能力。作为迈向临床试验的重要一步，在实现大规模生产外泌体或载药外泌体方面也取得了进展。纳米穿孔等仪器和程序的突破也解决了装载和生产的瓶颈。综上所述，随着基因编辑工具的发展和优化，基于外泌体的载体系统的不断发展将为靶向基因疗法提供动力，从而通过体外和体内途径将其作为未来难治疾病的可行疗法（图 5）。
DuanL, Xu L, Xu X, Qin Z, Zhou X, Xiao Y, Liang Y, Xia J. Exosome-mediated deliveryof gene vectors for gene therapy. Nanoscale. 2020 Dec 22.doi: 10.1039/d0nr07622h. Epub ahead of print. PMID: 33350419.
