综述 | Trends in immunology：单细胞转录组学和谱系追踪等方法揭示了巨噬细胞在眼和心脏中的可塑性和功能
编译：雪源，编辑：小菌菌、江舜尧。
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巨噬细胞是炎症反应和组织重塑中的重要介质。近期对巨噬细胞亚群异质性的新见解使得它们在维持体内稳态和疾病中的作用再次受到关注。巨噬细胞的可塑性使它们能够对不同的组织环境（如衰老引起的组织变化）作出相应的应答进而执行不同功能。因为这些特性使巨噬细胞的研究特别有趣，如血管系统和眼睛特别容易受到衰老的影响，而巨噬细胞在防止或加速心血管系统和眼睛疾病方面具有双重作用。本文基于巨噬细胞生物学的最新研究，介绍了巨噬细胞的来源和功能的多样性，同时也对影响巨噬细胞功能的机制进行阐述，以期为心血管系统疾病和眼科疾病提供新治疗策略。
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DOI号：doi.org/10.1016/j.it.2019.07.002
综述内容
1. 巨噬细胞来源、功能和可塑性在机体稳态和疾病调节中的新见解
由于哺乳动物体内不同巨噬细胞亚群处于不同的激活状态，其在机体稳态和疾病中的不同作用越来越受到关注。特定组织中不同巨噬细胞亚群对体内的稳态的扰动和组织微环境的变化具有不同的应答，从而发生动态变化。对巨噬细胞起源、功能和可塑性的新认识导致了对其机制研究的复杂性。特别是最近的谱系追踪、单细胞转录组学、形态学和分子分析方法的运用阐明了不同巨噬细胞亚群在调节机体发育、稳态中的关键作用。本文讨论了不同巨噬细胞亚群谱系的多样性、分子表达和表型活化的特异性，分析了其在机体内环境稳态和致病过程中的作用以及它们在心肌损伤、动脉粥样硬化、光感受器变性和年龄相关黄斑（AMD）小鼠模型中的贡献。这些新颖的机制证明了巨噬细胞的特异性和可塑性在疾病潜在治疗策略中的重要作用。
2. 常驻和招募的巨噬细胞的不同功能
十多年前，主流观点认为成年哺乳动物组织中的巨噬细胞只是从循环的单核细胞中衍生而来。这种观点虽然最初有争议，但现在人们普遍认为组织驻留的巨噬细胞并非来自渗透的单核细胞，而是从胚胎造血原体衍生而来。组织驻留和募集的巨噬细胞不仅发育起源不同，还具有独特的基因表达和功能特征。
长期以来人们将巨噬细胞用M1-M2二分法分为任意两类。M1巨噬细胞是由干扰素γ（IFN-γ）、微生物如脂多糖（LPS）和/或促炎症刺激产生的经典炎症细胞群体，而M2巨噬细胞与组织修复、伤口愈合有关，由特定的细胞因子如白细胞介素4（IL-4）刺激产生。尽管组织驻留巨噬细胞被归类为M2群体的一部分，并且单核细胞衍生的巨噬细胞主要是炎性M1样细胞，但最近研究人员意识到这种二分法过度简化。M1和M2巨噬细胞会分为不同的亚群，它们的表达谱和功能有许多不同，本文主要讨论这些内容。
3. 心脏驻留和募集的巨噬细胞的多种作用
许多情况下，心脏驻留巨噬细胞的功能和表达与心脏的功能有直接关系，而且即使同一个器官，也会有不同功能的巨噬细胞。例如，在小鼠和人心脏中驻留的巨噬细胞可以通过细胞趋化因子受体2（CCR2）的表达来区分。CCR2主要由浸润的Ly6C hi单核细胞巨噬细胞表达，在分化后维持CCR2表达。稳态条件下CCR2 +巨噬细胞通过弥散的单核细胞被分割成小的、长寿的常驻细胞群，称为“CCR2 +驻留巨噬细胞”。这些细胞具有强大的炎症反应潜能，并能在组织损伤后募集单核细胞和嗜中性粒细胞，导致各种心脏病模型中的组织损伤和不良反应。相比之下，CCR2 -常驻巨噬细胞是胚胎来源的巨噬细胞，具有降低炎症活性，并且参与机体各种过程，如冠状动脉发育，生物电传导和组织修复（图1），这也是传统意义上与M2巨噬细胞相关的过程。
图1 小鼠和人心脏巨噬细胞的起源和功能。（A）成熟的造血干细胞（HSC）起源于胎儿肝脏（FL）和骨髓（BM）。HSC分化产生募集的Ly6C hi / CCR2 +单核细胞，进而衍生成CCR2 +巨噬细胞。CCR2 -巨噬细胞时从骨髓造血祖细胞（EMPs）分化而来，也可从卵黄囊的特定FL和HSC分化生成。FL单核细胞来源于卵黄合胞体层（YSL）的EMP细胞群，仍是一个知之甚少的细胞群。（B）心脏再生和疾病中巨噬细胞的作用。在新生小鼠和低等脊椎动物中具有再生能力的心脏，心脏损伤/切除导致CCR2 -巨噬细胞在损伤部位增殖，促进非纤维化修复。成年鼠心脏不具有再生能力，心肌梗死（MI）时，驻留的CCR2 -巨噬细胞死亡，单核细胞衍生的巨噬细胞保持表达CCR2的能力。后者被招募到梗塞部位促进炎症和刺激胶原蛋白的沉积，导致损伤部位纤维化。在心脏衰竭的情况下，CCR2 -巨噬细胞被招募到心衰部位，但不局限于某一特定部位，形成间质纤维化，使心室壁硬化，进而降低心脏功能。放射性标记法还证明CCR2 +细胞被募集到人的急性MI部位和心衰部位。虽然招募单核细胞衍的巨噬细胞主要促进炎症反应，但与大多数招募的细胞群相比，只有少部分募集巨噬细胞表现出伤口愈合特性。缩写：MΦ，巨噬细胞。
虽然单核细胞衍生的巨噬细胞主要显示M1样炎症反应，但这些细胞也可能获得M2样抗炎表型。通过IL-13激活募集的巨噬细胞对心肌炎具有抗炎的作用。在感染柯萨奇病毒B3的小鼠中，重组IL-13的引入能恢复射血分数，并通过M2巨噬细胞极化减轻炎症反应。此外，小鼠谱系追踪结果表明，血液单核细胞也可以被招募并在多种组织中发挥驻留巨噬细胞的作用。靶向敲除的研究结果表明募集的巨噬细胞具有可塑性，并可能在组织中发挥稳态调节作用。总之，这些研究证明常驻和招募的巨噬细胞的高度塑性和异质性，它们的分化和激活功能可以作为药物治疗的潜在“靶标”。
4. 单细胞转录组学揭示心脏或组织中存在多种功能的巨噬细胞亚群
过去的一年中，许多研究利用单细胞测序技术，发现在人和小鼠模型中，心脏、肝脏、肺和主动脉等组织在稳态和疾病条件下，常驻和募集的巨噬细胞的表达谱具有显着的多样性。
健康小鼠心脏scRNA-Seq富集结果发现不同巨噬细胞亚群显示出不同的功能。Pathway分析显示显著富集Timd4和淋巴管内皮透明质酸受体1（Lyve1）的巨噬细胞簇同时高表达与细胞再生、血管生成和内吞作用的相关基因。富集经典炎症通路如IL-12，IFN-γ和I型IFN等的巨噬细胞簇能高表达CCR2和干扰素刺激基因（ISG），进而产生更多的炎症成分。
同时在其他组织中进行的研究也显巨噬细胞的这种异质性。一项小鼠部分肺切除术的研究表明，小鼠肺部存在更多的巨噬细胞簇，如表达Arg1 +的巨噬细胞簇。与心脏中发现的结果相似，当CCR2被敲除时，损伤部位募集的巨噬细胞则会减少。当然也有相反的结果，肺组织中募集的CCR2 +巨噬细胞与肺切除术后组织恢复和再生相关，因为在没有CCR2+巨噬细胞的情况下肺组织不能充分再生。这说明招募巨噬细胞在不同组织中具有不同功能。此外，健康和急性炎症条件下，小鼠肺中存在多个常驻和招募的巨噬细胞群，这些巨噬细胞群对炎症过程表现出不同的转录谱。动脉粥样硬化的小鼠模型、人正常的肝脏以及其他组织中都发现了类似的现象，即不同聚类条目富集出不同的巨噬细胞类型。总的来说，单细胞测序细化了常驻和招募的巨噬细胞亚群的高度异质性，从而证明了M1-M2分类之外表征其他巨噬细胞的重要性，为疾病标志物的发现和药物的靶向治疗提供基础。
5. 眼内巨噬细胞谱系多样性
跟心脏中类似，眼在健康或患病状态下也具有不同起源的多个巨噬细胞群（图2）。小胶质细胞是小鼠中枢神经系统（CNS）的一种长寿，自我补充的驻留单核巨噬细胞群，来源于卵黄囊。视网膜小胶质细胞以及CNS其他地方的小胶质细胞具有许多共同特征：它们都参与发育过程中突触环路的形成，且在健康状态下呈网状分布。但成人视网膜小胶质细胞表现出独特的空间结构，形成视网膜的突触内丛状层（图2）。最近一项用静息小胶质细胞标记物Tmem119和无监督聚类分析的scRNA-Seq结果发现，健康状态下几乎所有视网膜分离的单核巨噬细胞都由小胶质细胞组成。但在疾病背景下，常驻小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞在视网膜中的作用尚不清楚。值得注意的是，生理状态下在视网膜IBA1免疫染色表明小胶质细胞仅存在于视网膜突触内丛状层，且外丛状层未发现光感受器。但在不同色素性视网膜炎（RP）小鼠模型中，小胶质细胞出现在外丛状层且光感受器有缺失。表明小胶质细胞在介导光感受器退化中起致病作用。
但对于募集的单核细胞在加剧或减轻光感受器变性中的作用还存在争议。研究发现在Rd10的RP模型中，敲除CCR2消除单核细胞的募集能部分挽救视网膜结构、光感受器形态和功能。但也有学者认为单核细胞源性巨噬细胞在光感受器退化中的作用较小。而且通过玻璃体内注射C-C趋化因子配体2（CCL2）中和抗体或用基因消融Müller胶质细胞的CCL2来消除单核细胞的募集，并不能减轻该模型导致的光感受器退化，这表明浸润的单核细胞可能不会加剧光感受器的退化。
研究还表明眼中驻留和募集巨噬细胞在健康和疾病状态下具有显着异质性，其中不同的巨噬细胞群可能具有不同的功能。因此更好地了解常驻和招募巨噬细胞之间的动态变化，以及每个亚群间的动态变化具有重要意义。不同条件下研究特定组织内的单核细胞/巨噬细胞动力学以及不同巨噬细胞亚群作用的利害机制可能是开发治疗眼部炎症相关疾病的重要潜在靶点。
图2 小鼠视网膜巨噬细胞谱系和健康与疾病的活化（A）健康状态下视网膜小胶质细胞分布在外网状层（OPL）和内网状层（IPL）。不同的视网膜小胶质细胞群占据不同的区域，IL-34依赖性小胶质细胞存在于IPL内，而IL-34非依赖性小胶质细胞在OPL内。单核细胞在脉络膜和视网膜毛细血管内循环，其通过血 - 视网膜屏障与视网膜分离。（B）在光诱导的光感受器变性或色素性视网膜炎中，小胶质细胞伴随着它们相应的基因表达和功能特征，迁移到光感受器层和视网膜下腔以吞噬感光器碎片（绿色和蓝色箭头）。IPL和OPL的常驻小胶质细胞有助于其迁移，但对促进或阻止视网膜色素上皮（RPE）消亡的作用尚有争议。单核细胞衍生的募集巨噬细胞是否可以通过各种血管渗透入视网膜并导致光感受器变性（紫色箭头）也存在争议。（C）干性年龄相关性黄斑变性（AMD）中，富含脂质的沉积物（玻璃疣）在布鲁赫膜（BrM）或视网膜下积聚引起炎症，导致RPE和光感受器死亡。实验模型表明这是由M1样巨噬细胞介导的炎症作用引起的。湿性AMD的特征是脉络膜新生血管（CNV）生成。来自脉络膜的新血管通过BrM和RPE进入视网膜下腔。小鼠CNV模型显示M1-和M2-样巨噬细胞具有保护和致病作用。
6. 巨噬细胞在年龄相关疾病发病机制中的变化
新进研究表明巨噬细胞在机体衰老机制起到至关重要的作用，它可以从疾病保护状态转变为对疾病的促进状态。在哺乳动物心脏中，新生儿期之后巨噬细胞逐渐失去其再生能力，反而会促进心肌损伤后的炎症和纤维化。此外，老年巨噬细胞还可以获取泡沫细胞，进而促进动脉粥样硬化斑块和血管斑块生成，从而导致心肌梗死和中风。在眼睛中，巨噬细胞可促进导致出血和纤维化疾病，如AMD。此外，巨噬细胞衰老和表型可塑性还可以影响其他与年龄相关的病理过程，包括胰岛素抵抗和神经变性。
6.1. 心脏再生和疾病中的巨噬细胞
巨噬细胞通过分泌多种复杂的细胞因子、生长因子和细胞外基质蛋白等在心肌伤口愈合和恢复中发挥重要作用。生理状态下小鼠心脏组织驻留的巨噬细胞约占8％，这些细胞可以通过免疫监视、促进血管生成和抑制炎症调节组织稳态。此外，巨噬细胞在心脏再生中也起重要作用。与模式动物类似，哺乳动物的心脏在新生儿阶段也具有强健再生的能力。此时巨噬细胞能通过细胞外基质对新血管形成和重塑以及心脏再生中起关键作用。
相反，在短暂的新生儿期后，哺乳动物的心脏不再具有再生功能，此时巨噬细胞可能在心脏损伤部位形成纤维化病变。新生小鼠心脏胚胎来源的驻留巨噬细胞扩增对损伤后的心脏具有保护作用。虽然成年小鼠也有胚胎来源的驻留巨噬细胞，但当心肌损伤后不会扩增，而是被缺乏修复能力的单核细胞来源的浸润型巨噬细胞代替。在小鼠心肌梗死模型中，胚胎来源的常驻巨噬细胞会在5分钟内累积在损伤部位，一旦形成梗死这些巨噬细胞又会迅速死亡。在损伤部位CCL2和CCL7会招募单核细胞衍生的巨噬细胞并在很大程度上取代常驻巨噬细胞，同时损伤部位出现炎性中性粒细胞群也在24 h内达到峰值。此外，相对于早期发育阶段，衰老期心脏中巨噬细胞也转变为促炎的巨噬细胞群，这可能是导致心脏损伤时预后不良的重要原因。总之，因为巨噬细胞可以在心血管组织中发挥各种作用，所以可以将它的募集或增殖作为靶标，以期为改善心脏病变和/或促进心肌组织再生提供基础，但这仍需要进行进一步研究。
6.2. 年龄相关性黄斑变性（AMD）中巨噬细胞群的双重作用
尽管巨噬细胞在人类AMD中起到保护性还是致病性作用仍然未知，但其在AMD发病机制中的作用还是引起了越来越多的关注。眼损伤后巨噬细胞在疾病早起或晚期起到抗炎的保护作用还是促炎的致病作用也尚不明确。有学者认为炎性巨噬细胞在疾病早期中的致病作用是通过消除M1样巨噬细胞并减轻了疾病的表型。例如给小鼠视网膜下腔注射一种羧乙基吡咯修饰的血清白蛋白（CEP-MSA）会重现干性AMD的一些病理特征（包括布鲁赫膜损伤，RPE和光感受器死亡），同时会使M1样（TNF，IL-12，IL-6，IL-1β和CCL2）巨噬细胞表达升高。而CCR2敲除后消除了巨噬细胞的募集，进而减少了CEP-MSA注射后AMD疾病发展，说明M1样炎性巨噬细胞在早期AMD疾病中起到促进致病的作用。也有学者证实M1样巨噬细胞可能在新血管形成后期中发挥作用。具体而言，在激光诱导的CNV和氧诱导的视网膜病变模型中，敲除或用抗体中和IL-17a基因会减少M1巨噬细胞而增加M2样巨噬细胞水平，进而引起新血管形成减少。相反的，在玻璃体内添加重组IL-17a蛋白会导致M1样巨噬细胞增加，这表明M1巨噬细胞可能具有致病性，或M2样巨噬细胞对眼部新血管形成具有保护作用。
但目前AMD中M1和M2样巨噬细胞的功能仍存在争议。M1和M2样巨噬细胞可能都是AMD的致病因素。因为AMD的发病机制涉及早期M1介导炎症反应，也涉及M2介导的异常愈合反应。此外，每个巨噬细胞群在疾病的不同阶段有不同作用，巨噬细胞的激活和可塑性也能通过经典和非经典的巨噬细胞同时调节组织炎症和血管生成，但其具体机制仍需要进一步研究。
结束语
巨噬细胞的来源、表型和可塑性表现出很大的差异。在不同组织和不同疾病状态下，巨噬细胞的功能会随着环境的不同出现预防或加剧疾病的作用。而目前巨噬细胞多样性及其作用机制这个领域的研究才刚刚开始。通过了解心血管系统和眼睛中巨噬细胞亚群基因表达和功能方面取得的进展，为探究巨噬细胞的调控机制奠定了基础。当然目前巨噬细胞功能研究中仍存在许多挑战，尤其是需要改变用M1 / M2表征巨噬细胞的现状，可以更多地利用单细胞分析如scRNA-Seq来进一步表征巨噬细胞的发育和激活。还需要结合相关疾病模型来解决不同巨噬细胞亚群在不同年龄或疾病中的作用，解决目前尚存的巨噬细胞在促进或保护疾病进程中存在的争议。尽管存在众多挑战，研究巨噬细胞的功能多样性能为巨噬细胞介导的疾病过程提供重要的潜在的治疗靶点。