科研 | 国人佳作：转录组学和代谢组学的结合揭示了蚯蚓对长期暴露在土壤中的TiO2纳米粒子的响应
编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。
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二氧化钛纳米粒子（nTiO2）目前应用广泛，势必会排放到环境中，这引起了人们对nTiO2对生物菌群的潜在毒性的关注。然而，有关nTiO2对土壤无脊椎动物的长期影响的研究较少。本研究首次探究了不同浓度nTiO2（0、5、50和500 mg/kg）对土壤蚯蚓（Eisenia fetida）表型、转录和代谢方面的长期影响（120 d）。通过研究发现，nTiO2的长期暴露对蚯蚓的生长、繁殖和Ti含量无显著影响，但对蚯蚓的抗氧化系统、转录以及代谢组学方面影响显著。其中，在500 mg/kg的nTiO2处理下，超氧化物歧化酶（SOD）活性和还原谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值显著降低。代谢组学分析表明，在500 mg/kg处理下，参与GSH代谢中的甘氨酸和焦谷氨酸含量发生了显著变化。此外，长期接触nTiO2会影响碳水化合物、蛋白质和脂类的合成。然而，转录结果表明，真核生物途径中参与核糖体生物发生的基因和TGF-β信号通路有所上调，这解释了蚯蚓的生长和繁殖为什么不受nTiO2暴露的影响。通过整合转录组学和代谢组学结果，研究者揭示了传统毒性终点无法观察到的整体反应，这为评估工程纳米粒子在环境中的长期生态效应提供了有力的理论支撑。
论文ID
原名：Integration of transcriptomics and metabolomics reveals the responses of earthworms to the long-term exposure of TiO2 nanoparticles in soil
译名：转录组学和代谢组学的结合揭示了蚯蚓对长期暴露在土壤中的TiO2纳米粒子的响应
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间：2020年2月接收（6月发表）
通讯作者：林道辉
通讯作者单位：浙江大学（Zhejiang University）
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2020.137492
实验设计
本研究长期暴露试验所有土壤采集自杭州平遥镇的稻田土。蚯蚓（Eisenia Fetida）购买自蚯蚓养殖场。在试验前，蚯蚓在所采集的土壤中进行预培养，以牛粪进行喂养，为期两周。选择发育良好的健康蚯蚓进行后续暴露实验。所选蚯蚓个体体重控制在400~600 mg。约300 g土壤置于1 L烧杯中，每个烧杯横截面约100 cm2，土壤深度约5~6 cm。根据添加量不同，实验设定0、5、50和500 mg/kg的TiO2终浓度。每个烧杯放置10条蚯蚓，暴露为期120 d，实验期间，每个土壤表面供给10 g的湿牛粪喂食蚯蚓，每周1次。饲养温度20±1°C，日照16 h（8:00~24:00，600lx）。通过添加超纯水使土壤含水率达到WHC的50%。暴露结束时，对蚯蚓进行计数，并将其转移到湿滤纸上，以清除肠道内容物。记录蚯蚓的体重，并计算其增重率。蚯蚓产生的茧在土壤中再保存28天，随后计算孵化出的幼虫数量。
结果
1 nTiO2对蚯蚓的生长和繁殖的影响
暴露120 d内未见蚯蚓死亡。暴露120d后，不同浓度nTiO2处理组（0、5、50以及500 mg/kg）中蚯蚓的增重率分别为11.42 ± 4.49%、8.53 ± 2.74%、12.80 ± 3.39%和9.87 ± 1.56%（图1A）。不同浓度nTiO2处理组（0、5、50以及500 mg/kg）中每条蚯蚓产仔数分别为18.0 ± 1.2、20.0 ± 1.5、19.7 ± 1.5和17.7 ± 1.7（图1B）。在对照组和处理组之间，体重增重率和产仔数没有显著差异。
2 nTiO2浓度不影响其在蚯蚓体内的积累
如图1C所示，不同浓度nTiO2处理组（0、5、50以及500 mg/kg）中蚯蚓体内的Ti含量分别为12.64 ± 1.10、13.05 ± 0.52、13.67 ± 0.35和14.36 ± 0.68 mg/kg。不同浓度的nTiO2暴露120 d后，蚯蚓体内的Ti含量随nTiO2浓度的增加略有增加，但没有观察到明显的生物积累现象。
3 nTiO2对蚯蚓的表皮无影响
如图2所示，对照组蚯蚓表皮排列整齐，角质层结构完整。同样，在5、50以及500 mg/kg nTiO2处理组中也没有观察到角质层或表皮损伤的现象。
4 nTiO2对蚯蚓抗氧化系统的影响
如图3A所示，暴露120 d后，5、50和500 mg/kg nTiO2处理组中蚯蚓的SOD活性显著降低。在nTiO2处理下，谷胱甘肽/谷胱甘肽脱氢酶（GSH/GSSH）比值均降低，但仅在500 mg/kg处理下降低显著（图3B）。与对照相比，不同nTiO2处理下，ROS水平（图3C）、CAT活性（图3D）以及MDA含量（图3E）均没有显著变化。但随着nTiO2浓度的增加，CAT活性表现出略有下降的趋势，而ROS水平和MDA含量表现出略有上升的趋势。
5 nTiO2对蚯蚓代谢方面的影响
基于GC-MS的非靶标代谢组学，研究者探究了nTiO2长期暴露对E. fetida代谢水平的潜在影响。其中，共检测到了43种代谢物。与对照组相比，在5 mg/kg nTiO2处理组中，仅有D-麦芽糖含量显著降低，而500 mg/kg nTiO2处理组的甘氨酸、D-麦芽糖、D-talose、蔗糖、焦谷氨酸、allose、顺丁烯二酸和琥珀酸的含量均有明显变化（p < 0.05）（图4A）。对显著改变的代谢物的KEGG途径富集分析表明，暴露于500 mg/kg nTiO2后，淀粉和蔗糖代谢途径以及谷胱甘肽代谢途径显著富集（图4b）。
5 nTiO2对蚯蚓转录组的影响
本研究中所获得的RNA-Seq的原始数据以上传至NCBI数据库中，所获得登录号为PRJNA606843。与对照组相比，5和500 mg/kg nTiO2组中的差异表达基因（DEGs）分别为107条（包括44条上调基因和63条下调基因）和118条（包括48条上调基因以及70条下调基因）（图5A和图5B）。采用qRT-PCR技术对其中随机选择10条DEGs进行验证发现，其所得数据与RNA-Seq分析之间表现出相似的表达模式，这一发现确保了转录组测序数据的可靠性。
5 mg/kg nTiO2处理组DGEs富集分析并未发现明显变化的KEGG途径（p < 0.05）。KEGG途径富集分析显示，在500 mg/kg nTiO2处理组上调基因中，氨基糖以及核苷酸糖代谢、真核细胞核糖体生物合成和TGF-β信号通路均显著丰富。而在下调的基因中，类固醇生物合成和蛋白质消化吸收途径显著富集（图5C）。
讨论
在本研究中，相比与对照组，不同浓度nTiO2处理组中蚯蚓的增重率和产仔数无显著差异，说明长期nTiO2暴露对蚯蚓的生长和繁殖没有显著影响。先前已有研究表明，在为期28 d的实验中，低于1000 mg/kg的nTiO2暴露对人工土壤中E. fetida的产茧量无显著影响。本研究中，为期120 d的暴露周期中，不同浓度的nTiO2暴露下，蚯蚓中Ti含量无明显变化。但随着暴露浓度的增加，蚯蚓体内的Ti含量略有增加。先前的研究发现，通过不同浓度的nTiO2暴露7天后，也有类似的Ti在蚯蚓中的生物积累的现象，其中100和500 mg/kg nTiO2处理组的Ti生物积累略有增加但未表现出统计学差异，而1000 mg/kg和5000 mg/kg的nTiO2处理组显著增加了蚯蚓体内的Ti含量。据报道，抗氧化性溶解的Au纳米颗粒也积累在蚯蚓的肠腔中，此外，如果蚯蚓外部角质层存在侵蚀或外膜受损的情况，纳米颗粒很可能会渗透到组织中。在本研究中，nTiO2处理下蚯蚓的皮肤表皮层和角质层结构基本完好（图2），表明nTiO2暴露对蚯蚓皮肤没有造成明显的损伤，这恰好解释了为什么Ti在蚯蚓体内并未明显发生生物积累量的现象。
SOD和CAT的诱导是一种重要的保护性响应，这种响应可以将细胞内的氧化损伤降至最低，并在不利环境中充当中和ROS毒性的第一道防线。它们使过氧自由基歧化，分解过氧化氢从而形成无害的分子。谷胱甘肽（GSH）作为二线防御抗氧化剂防线之一，也是细胞内合成的最重要的低分子抗氧化剂。GSH的缺乏会使细胞面临氧化损伤的风险。GSH/GSSG比值是氧化应激的一种衡量标准。在本研究中，GSH/GSSG比值的降低表明在蚯蚓体内存在氧化应激。由丙二醛（MDA）含量表示的脂质过氧化表明，在动物组织中发生了自由基反应。在本研究中，活性氧（ROS）和MDA含量在暴露于nTiO2后保持稳定，表明E. fetida似乎通过其抗氧化系统成功地抵抗了长期暴露nTiO2所造成的氧化胁迫。而SOD活性和GSH/GSSH比值的降低则表明E. fetida的抗氧化能力在长期nTiO2暴露下有所减弱。
长期暴露于500 mg/kg nTiO2后，甘氨酸、D-麦芽糖、D-talose、蔗糖、焦谷氨酸、allose、顺丁烯二酸和琥珀酸的含量发生了显著变化。D-麦芽糖和蔗糖参与淀粉和蔗糖的代谢，其两者含量的下降进一步表明，nTiO2暴露影响了碳水化合物的合成。在受显著影响的代谢物中，甘氨酸和焦谷氨酸参与了谷胱甘肽（GSH）的代谢。GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸形成的三肽。甘氨酸是合成GSH的原料，焦谷氨酸是GSH代谢的中间产物。GSH通过反馈抑制调节γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。GSH的消耗导致γ-谷氨酰半胱氨酸含量的增加，而γ-谷氨酰半胱氨酸又可以通过GSH-谷氨酰环转移酶代谢形成胱氨酸和焦谷氨酸。在本研究中，GSH转化为GSSH，GSH含量的降低会导致焦谷氨酸含量的降低。甘氨酸含量的增加可能是长期低水平GSH的蚯蚓的一种补偿作用。
先前的研究表明，nTiO2可以通过产生活性氧增加细胞内的氧化应激，从而损害蛋白质、碳水化合物、脂质和DNA。在本研究中，与氨基糖和核苷酸糖代谢相关的基因上调，与类固醇生物合成和蛋白质消化吸收途径相关的基因下调，这一发现表明长期暴露于nTiO2会影响碳水化合物、蛋白质和脂质的合成。核糖体在细胞活动中发挥关键作用，其生物发生是一项受到严格调控的活动，与包括生长和细胞分裂在内的其他基本细胞过程有着千丝万缕的联系。TGF-β信号通路参与许多细胞过程，包括细胞分化、细胞生长、细胞稳态、凋亡和其他细胞功能。这些途径中上调的基因可能阐明了蚯蚓的生长和繁殖没有受到nTiO2暴露影响的原因。
总结
综上所述，长期接触nTiO2不会影响蚯蚓的表型参数（生长和产量），但会显著影响蚯蚓的抗氧化系统以及转录和代谢组学特征。本研究首次通过系统的研究，阐述了蚯蚓对长期nTiO2处理的响应。转录组学和代谢组学的整合分析为蚯蚓对土壤中nTiO2的响应提供了更灵敏的测量方法。低浓度（5 mg/kg）的nTiO2对蚯蚓的mRNA和代谢物有不良影响，比以往报道的影响蚯蚓传统终浓度（> 1000 mg/kg）低3个数量级。本研究的发现对纳米颗粒的生态风险评估具有重要意义，并支持生态毒理学的范式转变。
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